Цкп «Генетический полиморфизм» обн ран

Скачать 386.13 Kb.

Название	Цкп «Генетический полиморфизм» обн ран
страница	4/4
Тип	Обзор

rykovodstvo.ru > Руководство эксплуатация > Обзор

1 2 3 4

3.1.4. Проверка работоспособности тест-системы в формате ПЦР «в реальном времени»

На выбранные системы X1 и Y4 были подобраны проявляющие олигонуклеотидные зонды и проведена ПЦР «в реальном времени» (Рис.13, 14). Проверка показала, что выбранные зонды срабатывают достаточно хорошо.

Тест-система на Х хромосому работает чуть хуже, чем на Y, что позволяет в случае, когда срабатывает лишь Y, более уверенно говорить, что был проанализирован образец ДНК самца (см. рис 15).

Рисунок 13. Проведение ПЦР «в реальном времени» на образце ДНК самца амурского тигра. Как видно из графика, сработали обе тест-системы (Х1 и Y4).

Рисунок 14. Проведение ПЦР «в реальном времени» на образце ДНК самки амурского тигра. Как видно из графика, сработала только одна тест-система (на Х хромосму).

Рисунок 15. Проведение ПЦР «в реальном времени» на образцах ДНК двух самцов. Видно, что не прореагировала тест-система на Х-хромосому (возможно, вследствие малого количества стартовой ДНК).

3.2 Создание тест-системы для идентификации особи тигра по однонуклеотидному полиморфизму в геноме

3.2.1 Подбор праймеров на предположительно вариабельные генетические маркеры (однонуклеотидный полиморфизм)

Для создания тест-систем на SNP в геноме тигра нами были использованы данные анализа генома из работы Чо с соавторами (Cho et al, 2013). Поскольку в публикации отсутствовали данные о расположении SNP относительно хромосом (желательно было бы взять SNP, расположенные на разных хромосомах), для создания тест-систем были выбраны 4 случайных региона с SNP. На первых 4-х маркерах планировалось отработать систему заказа и проверки срабатывания тест-систем, после чего довести число маркеров до 20.

В программе Oligo 6.0 были подобраны олигонуклеотиды на предположительно вариабельные генетические маркеры (SNP). Для каждого региона были подобраны две пары праймеров, ограничивающих регион, включающий SNP, два олигонуклеотида с разными флуоресцентными метками (FAM и VIC) и один олигонуклеотид с гасителем флуоресценции (BHQ). В табл. 4 приведены выбранные последовательности олигонуклеотидов.

Таблица 4. Подобранные последовательности олигонуклеотидов SNP.

Название системы	Последовательности праймеров	Последовательности двух олигонуклеотидов с флуоресцентными метками^*	Последовательности олигонуклеотидов с гасителем флуоресценции^*
S1	GATGTAGGCTCAGCTTGTGACAGAG AGTTTGCCCCTTCACCCTAATG	ATGAAACCAGGACCC-FAM ATGAAAGCAGGACCC-VIC	BHQ-TCCTACGTGCCTTGCTCTA-P
S2	ACAAAAGGGATTGTTACATGGGAGC CCCTGTGTATGGTGCTGGAAATAGT	CCTGTCCATCTGAAGC-FAM CCTGTCGATCTGAAGC-VIC	BHQ-ATAATCCAGAGCAAGTTCAAA-P
S3	AGGTTTTACCCAAATTACGTTCCCA CTGGCACCTTGAGTTTGGACTTCTA	CACTCACAAACCATGC-FAM CACTCACAAATCATGC-VIC	BHQ-TAGTTTCCTTGGGCTGCT-P
S4	CCCTTTCCCATTTTCAAAAGCTAAA TCAAGTGATGAAGTCCCAACCAACT	GGTTTCTTTTACTTGCA-FAM GGTTTCTTCTACTTGCA-VIC	BHQ-ACCAAAGAAATAATTTGATCG-P

* - Полиморфная позиция выделена шрифтом. Р – остаток фосфорной кислоты.

3.2.2 Проверка работоспособности тест-систем на SNP

При проверке тест-систем, четкие графики были получены лишь для систем S1 и S2, которые и приведены ниже. По результатам эксперимента удалось генотипировать двух тигров (мышечная ткань, самцы) по однонуклеотидному полиморфизму. Совершенствование и создание следующих систем планируется в продолжении работы.

Рисунок 16. Анализ графиков, полученных при постановке SNP тест-систем (S2, самец1 (мышечная ткань))). Точки максимума находятся примерно на одном перпендикуляре, что говорит о равном С_р, а это значит, что праймеры отходили равномерно, следовательно данный тигр гетерозиготен.

Рисунок 17. Анализ графиков, полученных при постановке SNP тест-систем (S1, самец2 (мышечная ткань))). Точки максимума находятся не на одном перпендикуляре, что говорит о неравном Ср, а это значит, что праймеры отходили неравномерно, следовательно данный тигр гомозиготен.

4. Выводы

Оптимальным количеством фекалий тигра для экстракции ДНК набором «Проба-ГС» является 25 мкл материала. При этом получается около 50000 геном/эквивалентов на образец. Пригодным количеством мышечной ткани тигра на одну экстракцию набором «Проба-ГС» является 3 мм³ материала.
Разработана тест-система для определения пола амурских тигров методом ПЦР «в реальном времени». Тест-система успешно срабатывает на образцах ДНК из фекалий и мышечной ткани.

5. Благодарности

Автор выражает благодарность П.А.Сорокину за предоставление образцов биологического материала для исследований и помощь в работе, а также А.Субботину за предоставление образцов биологического материала.

6. Список литературы

Д.В. Ребриков, Г.А. Саматов, Д.Ю. Трофимов, П.А. Семенов, А.М. Савилова, И.А. Кофиади, Д.Д. Абрамов., ПЦР в реальном времени., Бином. Лаборатория знаний., 2009.
В.В. Рожнов, П.А. Сорокин, С.В. Найденко, В.С. Лукаревский, Х.А. Эрнандес, М.Н. Литвинов, А.К. Котляр, В.Г. Юдин, Неинвазивная индивидуальная идентификация амурских тигров (Panthera Tigris altaica) молекулярно-генетическими методами, Доклады Академии Наук, том 429, №2, 2009, с. 278-282.
В.Е.Соколов, М.С. Гиляров, Ю.И. Полянский, Жизнь животных (7 том)., в 7 т., Просвещение, 1989.
Ю.А. Столповский, А.Н. Евсюков, Г.Е. Cулимова, Геномное разнообразие по маркерам межмикросателлитного полиморфизма у пород крупного рогатого скота // Генетика. 2013. Т. 49. №5. с.641-648.
Ю.А. Столповский, Полиморфизм молекулярно-генетических маркеров у овец романовской породы // Известия ТСХА, выпуск 2. 2008 с. 131-136.
М.В. Теликов, ”Кари Маллис, изобретатель ПЦР”, «Химия и жизнь», №8, 2006 г, стр.6.
Cho YS, Hu L, Hou H, Lee H, Xu J, Kwon S, Oh S, Kim HM, Jho S, Kim S, Shin YA, Kim BC, Kim H, Kim CU, Luo SJ, Johnson WE, Koepfli KP, Schmidt-Küntzel A, Turner JA, Marker L, Harper C, Miller SM, Jacobs W, Bertola LD, Kim TH, Lee S, Zhou Q, Jung HJ, Xu X, Gadhvi P, Xu P, Xiong Y, Luo Y, Pan S, Gou C, Chu X, Zhang J, Liu S, He J, Chen Y, Yang L, Yang Y, He J, Liu S, Wang J, Kim CH, Kwak H, Kim JS, Hwang S, Ko J, Kim CB, Kim S, Bayarlkhagva D, Paek WK, Kim SJ, O'Brien SJ, Wang J, Bhak J. The tiger genome and comparative analysis with lion and snow leopard genomes. Nat Commun. 2013;4:2433.
Christopher J. Connora, Hongliang Luoa, Brian B. McSpadden Gardenerb, Hua H. Wanga, Development of a real-time PCR-based system targeting the 16S rRNA gene sequence for rapid detection of Alicyclobacillus spp. in juice products, International journal of food microbiology., 2005., Volume 99, Issue 3, p. 229-235
Echegaray J., Villa C., Noninvasive monitoring of wolves at the edge of their distribution and the cost of their concervation, Animal concervation, 2009, Issue 1367-9430, p. 1-5
Henry P., Miquelle D., Sugimoto T., Mccullough D. R., Caccone A., Russello M. A., In situ population structure and ex situ representation of the endangered Amur tiger, Molecular ecology, 2009, Volume 10, Issue 1, p. 1- 12
Higuchi R., Fockler C., Dollinger G., Watson R., Kinetic PCR: Real time monitoring of DNA amplification reactions., Biotechnology., 1993, v.11, p. 1026-1030
Higuchi R., Dollinger G., Walsh P. S., Griffith R., Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences., Biotechnology., 1992., v. 10., p.413-417
Holly B. Ernest, Esther S. Rubin, Walter M. Boyce, Fecal DNA analysis and risk assessment of mountain lion predation of bighorn sheep, Journal of Wildlife Management, 2002, Volume 1, Issue 66, p. 75-85.
Menotti-Raymond M, David V, Lyons L, Schaffer A, Tomlin J, Hutton M, O'Brien S, A Genetic Linkage Map of Microsatellitesin the Domestic Cat (Felis catus), Genomics, 1999, Volume 57, Issue 43, p. 9-23
Michelle L. Green, Denise L. Herzing, John D. Baldwin, Noninvasive methodology for sampling and extraction of DNA from free-ranging Atlantic spotted dolphins (Stenella frontalis), Molecular ecology notes, 2007, Issue 7, p. 1287-1292
Okello J.B., Wittemyer G., Rasmussen H.B., Douglas-Hamilton I., Nyakaana S., Arctander P., Siegismund H.R., Noninvasive genotyping and mendelian analysis of microsatellites in African savannah elephants, Journal of Heredity, 2005, Volume 6, Issue 96, p. 679-687
Sugimoto T, Nagata J, Aramilev V, McCullough D, Population size estimation of Amur tigers in Russian Far East using noninvasive genetic samples, Journal of Mammalogy, 2012, Volume 93, Issue 1, p. 93-101

Список ссылок на электронные ресурсы.

[http://www.zoopicture.ru/stellerova-korova/]
[http://crazy-zoologist.livejournal.com/146107.html]
[http://www.bigcatfiles.info/tiger/]
[http://www.bigcatfiles.info/tiger/yavanskij-tigr/]
[http://www.wwf.ru/resources/news/article/2723]
[http://www.wwf.ru/resources/news/article/1688]
[http://www.wwf.ru/resources/news/article/1564]
[http://www.wwf.ru/resources/news/article/12118],
[http://www.wwf.ru/resources/news/article/12268],
[http://www.wwf.ru/resources/news/article/9222]
[http://www.wwf.ru/resources/news/article/9286]
[http://www.wwf.ru/resources/news/article/9497]
[http://www.nnzoo.ru/mammals/218-amurskiy-tigr-panthera-tigris-altaica.html]
[https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%90%D0%BC%D1%83%D1%80%D1%81%D0%BA%D0%B8%D0%B9_%D1%82%D0%B8%D0%B3%D1%80#mediaviewer/File:Amur_Tiger_Panthera_tigris_altaica_Cub_Walking_1500px.jpg]
[http://news.vse42.ru/feed/show/id/2905365]
[http://www.wwf.ru/resources/news/article/1845]
[https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%90%D0%BC%D1%83%D1%80%D1%81%D0%BA%D0%B8%D0%B9_%D1%82%D0%B8%D0%B3%D1%80#.D0.A0.D0.B0.D1.81.D0.BF.D1.80.D0.BE.D1.81.D1.82.D1.80.D0.B0.D0.BD.D0.B5.D0.BD.D0.B8.D0.B5]
[http://www.bastak.ru/tigers2.html]
[http://www.ecosystema.ru/07referats/tiger/tiger.htm]
[http://www.murkota.ru/semeistvo-koshach-ih/amurskii-tigr.-razmnozhenie.html]
[https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%90%D0%BC%D1%83%D1%80%D1%81%D0%BA%D0%B8%D0%B9_%D1%82%D0%B8%D0%B3%D1%80 - .D0.9E.D1.85.D1.80.D0.B0.D0.BD.D0.B0
[http://humbio.ru/humbio/moldiagn/000072bd.htm]
[http://oftalmic.ru/diagn_rflp.php]
[https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9A%D0%BE%D1%80%D0%BE%D1%82%D0%BA%D0%B8%D0%B9_%D1%82%D0%B0%D0%BD%D0%B4%D0%B5%D0%BC%D0%BD%D1%8B%D0%B9_%D0%BF%D0%BE%D0%B2%D1%82%D0%BE%D1%80]]
[http://molbiol.edu.ru/review/04_03.html]
[http://sudexpa.ru/expertises/genetic/mt_dna/]
[http://www.gazeta.ru/social/2008/09/17/kz_2839539.shtml]
[http://molbiol.ru/protocol/#a12]
[https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9F%D0%BE%D0%BB%D0%B8%D0%BC%D0%B5%D1%80%D0%B0%D0%B7%D0%BD%D0%B0%D1%8F_%D1%86%D0%B5%D0%BF%D0%BD%D0%B0%D1%8F_%D1%80%D0%B5%D0%B0%D0%BA%D1%86%D0%B8%D1%8F#mediaviewer/File:Pcr.png]
[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome?linkname=gene_genome&querykey=3]

1 2 3 4

Похожие:

	О научно-образовательном центре коллективного пользования фгбун имби «Спектрометрия и хроматография» (далее – цкп) федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт морских биологических...		История россии Ран а. Н. Сахаров (отв редактор). докт ист наук В. П. Дмитренко (зам отв редактора), академик ран и. Д. Ковальченко, член-корр ран...
	Российская академия наук институт социально-экономического развития территорий ран Исэрт ран (ранее внкц цэми ран) продолжает знакомить своих подписчиков с наиболее интересными, на наш взгляд, публикациями, затрагивающими...		Полиморфизм ДНК микобактерий, вызывающих неспецифические туберкулиновые...
	Сравнительный эколого-генетический анализ микроспоридий и их хозяина... Сравнительный эколого-генетический анализ микроспоридий и их хозяина – байкальской амфиподы gmelinoides fasciatus		Краткая инструкция пользователя асу рид ран (ученого секретаря) Введение Данная инструкция адресована сотрудникам научных организаций ран, осуществляющим сбор данных по оценке результативности деятельности...
	О проведении открытого аукциона в электронной форме Наименование государственного заказчика: Учреждение Российской академии наук Институт неорганической химии им. А. В. Николаева Сибирского...		О проведении запроса котировок цен на право заключения государственного контракта Государственный заказчик: Учреждение Российской академии наук Институт неорганической химии им. А. В. Николаева Сибирского отделения...
	Извещение о проведении запроса котировок (запрос котировок) Государственный заказчик: Учреждение Российской Академии Наук Больница Пущинского научного центра ран (сокращенное бпнц ран)		Техническое задание Общие требования Учреждение Российской академии наук Ордена Ленина и Ордена Октябрьской революции Институт геохимии и аналитической химии им. В. И....
	Протокол заседания оус Цкп аналитическим оборудованием, оснащенных новейшими прецизионными высокопроизводительными приборами		Указатель литературы обменных фондов библиотек 2 2013 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственная публичная научно-техническая библиотека Сибирского отделения...
	Список научных публикаций сотрудников юнц ран Венков А. В. Антироссийское антисоветское движение (1917-1918 гг.) на Украине в годы Гражданской войны. Ростов-на-Дону: Изд-во юнц...		Молекулярно- генетический профиль дофаминовой нейромедиаторной системы... Работа выполнена в фгбу «Национальный научный центр наркологии» Миндзрава России
	Конкурс 2015 года По Программам ран программа фундаментальных исследований Президиума ран №1 Программа включает в себя три Подпрограммы (I – III). Подпрограмма I «Физика и технология наноструктур, наноэлектроника и диагностика»...		Инструкция по оформлению текстов докладов для опубликования в сборнике... Объединенный институт высоких температур ран, 111116, Москва, Красноказарменная, 17а

Руководство, инструкция по применению

rykovodstvo.ru