Химия растительного сырья

Скачать 3.83 Mb.

Название	Химия растительного сырья
страница	3/79
Тип	Обзор

rykovodstvo.ru > Руководство эксплуатация > Обзор

1 2 3 4 5 6 7 8 9 ... 79

1. Особенности строения пероксидаз

Лигнинпероксидаза (LiP) является хорошо изученной пероксидазой грибного происхождения, вместе с другими грибными пероксидазами ее относят к классу II надсемейства пероксидаз. Молекулярная масса ее составляет около 40 кДа. Изоэлектрические точки лежат в области pI = 3,2–4,7.

Она обладает высоким окислительно-восстановительным потенциалом, в результате чего имеет способность окислять не только фенольные, а еще и нефенольные модельные соединения лигнина, ароматические эфиры и полициклические ароматические соединения. Изоферменты Н2 и Н8 имеют очень близкие структуры с единой общей укладкой, принципиально сходной с укладкой пероксидазы хрена (HRP) – типичного представителя класса III растительных пероксидаз. Однако четыре дисульфидных мостика изофермента Н2 (Cys3–Cys15, Cys14–Cys285, Cys34–Cys120, Cys249–Cys317) расположены иначе, чем четыре аналогичных мостика HRP [14]. LiP содержит как соседствующие с гемом, так и отдаленные Са-связывающие сайты, однако в ней отсутствуют дополнительные структурные элементы между α-спиралями F и G, характерные для пероксидаз класса III. Активный центр LiP сходен с закрытой структурой активного центра HRP (так называемый гемовый карман) и отличается от других гемсодержащих белков: глобинов, каталазы, хлоропероксидазы и др., у которых гем экспонирован наружу. Как и у HRP, у изоферментов LiP, по данным разных авторов, ион Fe³⁺ имеет пять [15] или шесть лигандов [16] (рис. 1). Вероятно, различия в трактовке связаны с тем, что в определенных условиях координационное число гемового железа может изменяться. В работе [17] показано, что фермент может переходить из одной формы в другую. При 25 °С высокоспиновое трехвалентное железо в ферменте преимущественно имеет пять лигандов, как у HRP, а при 2 °С и ниже – шесть. Таким образом, LiP так же, как и HRP, имеет вакантную позицию для координации шестого лиганда, расположенную напротив пятого. Спектральное сходство рассматриваемых пероксидаз подтверждается исследованиями [29, 30], данные пероксидазы принадлежат к гемопротеинам с высокоспиновым железом Fe³⁺. Полоса Соре и другие полосы поглощения в видимой области близки для данных ферментов (табл. 1).

Рис. 1. Структура активного центра пероксидазы
Согласно литературным данным [18], предполагается, что для LiP и HRP окисление небольших субстратов происходит на δ-мезосайте гема (атом углерода между метильными группами 1 и 3, обеспечивающий перенос электрона от восстанавливающего субстрата окисленным интермедиатом фермента). Между тем LiP менее способна к модификации мезосайта гема и быстро инактивируется пероксидом водорода, в отличие от HRP. Также было высказано предположение о существовании в молекуле LiP двух различных субстрат-связывающих центров. Прямыми доказательствами этого предположения являются данные рентгеноструктурного анализа нативного фермента, приведенные в работе [19]. Первый (неспецифический) субстрат – связывающий центр – находится на δ-мезосайте гема, а второй (специфический) – вблизи Тrр171, который необходим для окисления классических субстратов данной пероксидазы.

Сходство строения активного центра ферментов, а именно наличие проксимального гистидинового остатка, дистального гистидинового остатка и аргининового остатка, расположенных сходным образом, подтверждаются также с помощью ЯМР-спектроскопии [32].

Таблица 1. Полосы поглощения лигнинпероксидазы (LiP), Mn-зависимой пероксидазы (МnР) из Ph. chrysosporium и пероксидазы хрена (HRP) [31]

Форма фермента	Максимумы полос, нм
Ферри-, высокоспиновая
LiP, pH 4,5	407	500	–	–	632
MnP, pH 4,5	406	502	–	–	632
HRP, pH 6,0	403	500	–	–	641
Ферри-, низкоспиновая
LiP–CN	423	–	540	–	–
MnP–CN	421	–	546	–	–
HRP–CN	422	–	539	–	–
LiP–N₃	418	–	540	575	–
MnP–N₃	417	–	542	580	–
HRP–N₃	416	–	534	565	–
Ферро-
LiP	435	–	–	556	–
MnP	433	–	–	554	–
HRP	437	–	–	556	–
Ферро-СО
LiP–СО	420	–	535	568	–
MnP–СО	423	–	541	570	–
HRP–СО	423	–	541	575	–
LiP ³⁸A H E S I R L V F H D S I A I S P ⁵⁴…¹⁶⁶ E L E L V W M L S A H S V A ¹⁷⁹ MnP ³⁷A H E V I R L T F H D A I A I S R ⁵³…¹⁶³ P F E V V S L L A S H S V A ¹⁷⁶ HRP ³³A A S I L R L HF H D C F VNGC ⁴⁹…¹⁶⁰S S D L V A L S G G H T F G ¹⁷³ а) б)
Рис. 2. Гомология в области активного центра у LiP, MnP, HRP. Идентичные и сходные остатки выделены [33]: а – проксимальный гистидин; б – дистальный гистидин

В настоящее время сложилось мнение, что субстраты классических пероксидаз растений можно разбить на три группы.

К первой относят двухэлектронные доноры электронов, для которых главным является связывание вблизи активного центра (у плоскости гема, иодит-ион) или даже проникновение внутрь активного центра.

Вторая группа представляет собой достаточно простые одноэлектронные ароматические субстраты, которые (как это было показано для феруловой кислоты) связываются вблизи активного центра HRP.

Третья группа – это субстраты, окисляющиеся по цепи переноса электронов.

В случае первой группы субстратов, механизм их окисления включает перенос феррильного кислорода на субстрат, для которого необходимо прямое взаимодействие субстрата с феррильным кислородом. Субстраты второй группы связываются вблизи активного центра фермента. В третьей группе субстратов, если предполагать отсутствие специфических взаимодействий субстрата с активным центром, субстратная специфичность определяется редокс-потенциалами субстратов и окисленных форм фермента и их стабильностью, так как каталитический процесс представляет собой окислительно-восстановительную реакцию. Это мнение основано на данных Данфорда о возрастании констант скорости восстановления окисленных форм фермента с ростом восстановительного потенциала в ряду замещенных аминов и фенолов [20–22].

В отличие от LiP и HRP марганецпероксидаза (МnР) не способна окислять наиболее устойчивые нефенольные подструктуры лигнина. Активность МnР полностью зависит от наличия Мn²⁺, который окисляется ферментом до Мn³⁺. Поэтому механизм действия МnР заключается в образовании сильного окислителя – Мn³⁺, который далее, независимо от фермента, окисляет различные соединения, т.е. служит в этой реакции редокс-медиатором. В настоящее время МnР найдена у нескольких десятков видов базидомицетов. Ее молекулярная масса составляет около 45 кДа, изоэлектрическая точка лежит в области pI = 3–4, содержание сахаров 10–17% [23]. Однако в литературе описаны некоторые истинные МnР, способные к марганецнезависимому окислению [24]. Так, МnР Ceriporiopsis subvermispora непосредственно окисляет некоторые ароматические амины, однако для окисления гваякола присутствие марганца необходимо. Структура МnР сходна со структурой HRP, LiP и других пероксидаз грибов и растений. Однако уникальной характеристикой фермента является марганецсвязывающий сайт. Сайт связывания Мn²⁺ в МnР впервые предсказан на основании гомологии фермента и LiP, а затем изучен рентгенографически в ферменте, закристаллизованном в присутствии Мn²⁺. Сайт его связывания расположен на поверхности белка и свободно доступен из раствора. Никаких других сайтов прочного продуктивного связывания Мn²⁺ в МnР не обнаружено, хотя ранее считалось, что сайт связывания марганца близок к δ-мезосайту гема в LiP и HRP (в нативном ферменте Мn²⁺ окружен четырьмя карбоксильными группами, одна из которых образует ионную пару с соседним остатком Argl77) [25]. Поэтому при окислении олигомерных фенольных моделей лигнина МnР гораздо менее реакционноспособна, чем LiP и HRP. Важным моментом является чувствительность ферментов к избытку пероксида водорода: LiP наиболее чувствительна к инактивации избытком пероксида водорода (инактивация наблюдается уже при 25-кратном его избытке), МnР менее чувствительна (требует 250-кратного избытка пероксида водорода), а наименее чувствительна HRP (выдерживает более чем 500-кратный избыток пероксида водорода), что характеризует последнюю как наиболее стабильную форму. Данный факт связан с повышением рН-оптимума этих ферментов (LiP – 3,0; МnР – 4,5; HRP – 6,0) [26].

Еще один фермент, относящийся к классу грибных пероксидаз (группа медьсодержащих оксидаз), – лакказа. Данный фермент один из немногих, исследуемых с конца XIX в. Все растительные лакказы являются мономерными белками с молекулярной массой 90–130 кДа и изоэлектрической точкой, находящейся в области pI = 3,0–5,1, и высоким содержанием углеводов 22–45%.[27]. До настоящего времени все функции лакказ не определены. Считается, что в растениях лакказы участвуют в синтезе лигнина, катализируя реакцию полимеризации структурных единиц лигнина, которая протекает по свободно-радикальному механизму. Основными физиологическими функциями грибных лакказ считается участие в процессах деградации лигнина, развития и морфогенеза грибов, в патогенезе и детоксикации. Однако лакказы не обладают специфичностью по отношению к субстрату-донору и способны катализировать окисление широкого круга неорганических и органических соединений. Таким образом, субстратами лакказы являются органические ароматические соединения, многие из которых представляют собой фенольные подструктуры лигнина. Разрушение нефенольных подструктур лигнина определяется редокс-потенциалом Т1 центра фермента (редокс-потенциал лакказ не превышает 800 мВ, в то время как потенциалы ионизации большинства нефенольных подструктур лигнина весьма высоки, более 1,4 В) [28].

Таким образом, особенности строения вышеприведенных пероксидаз, обуславливающие их субстратную специфичность по отношению к лигнинным соединениям, достаточно хорошо изучены; данные пероксидазы имеют схожее строение активного центра, однако наиболее широкое применение в процессе окисления лигнина нашли грибные пероксидазы: МпР, LiP, лакказа. Что же касается пероксидазы хрена, то ее использование ограничено небольшим кругом исследований в области окисления простых мономерных фенольных структур. При этом, с точки зрения практического применения, необходимо отметить ее высокую стабильность и более высокий рабочий рН-оптимум, в отличие от грибных пероксидаз. Отмеченные факты дают возможность предположить перспективность использования фермента – пероксидазы хрена, как катализатора процессов биодеградации лигнина.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 ... 79

Похожие:

	Г Основы заготовительного процесса растительного сырья (сбор, первичная... Заготовка лекарственного растительного сырья является многогранным процессом, охватывающим цикл операций, начиная со сбора и заканчивая...		Химия растительного сырья Ю. Д. Алашкевич, В. И. Белоглазов, В. К. Дубовый, Д. А. Дулькин, И. Н. Ковернинский, Б. Н. Кузнецов, А. В. Кучин, Ю. С. Оводов, Г....
	Химия растительного сырья Ю. Д. Алашкевич, В. И. Белоглазов, В. К. Дубовый, Д. А. Дулькин, И. Н. Ковернинский, Б. Н. Кузнецов, А. В. Кучин, Ю. С. Оводов, Г....		Химия растительного сырья Ю. Д. Алашкевич, В. И. Белоглазов, В. К. Дубовый, Д. А. Дулькин, И. Н. Ковернинский, Б. Н. Кузнецов, А. В. Кучин, Ю. С. Оводов, Г....
	Фармакогнозия Под подлинностью лекарственного растительного сырья понимают соответствие сырья Под доброкачественностью лекарственного растительного сырья понимают соответствие сырья		Заготовка сырья дикорастущих и культивируемых лекарственных растении Упаковка, маркировка, транспортирование и хранение лекарственного растительного сырья
	Общая фармакопейная статья Хранение лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов осуществляется в соответствии с офс «Хранение...		Курсовая работа по аптечной технологии лекарств на тему: «Современные... «Современные экстракционные лекарства из растительного сырья. Лекарственные формы»
	Бизнес-план развитие предприятия по сбору и переработке растительного... Обоснование рентабельности развития предприятия по сбору, переработке и экспорту для реализации на территории Российской Федерации...		Ростехнадзор приказ «Требования к применению взрыворазрядителей на оборудовании взрывопожароопасных производственных объектов хранения и переработки...
	Основной документ, регламентирующий приемку фасованного лрс Под доброкачественностью лекарственного растительного сырья понимают соответствие его		2. Место производственной практики в структуре ооп бакалавриата Кафедра: Товароведение, технология сырья и продуктов животного и растительного происхождения имени С. А. Каспарьянца
	Особенности заготовки и анализа дальневосточных видов лекарственного растительного сырья Выявить виды, морфологически сходные с лекарственными; научиться различать их между собой		Федеральный горный и промышленный надзор россии постановление Утвердить "Инструкцию по составлению планов ликвидации аварий и защиты персонала на взрывопожароопасных производственных объектах...
	Разработка и интенсификация процесса сублимационной сушки растительного... Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Дагестанский...		Отдел вирусологии и молекулярной диагностики Перечень нормативной... Му 3 1917-04 Порядок и организация контроля за пищевой продукцией, полученной из/или с использованием сырья растительного происхождения,...

Руководство, инструкция по применению

rykovodstvo.ru