Разработка технологии получения хондроитинсульфата из гидробионтов баренцева моря и изучение его физико-химических свойств
|
Скачать 298.31 Kb.
|
|
На правах рукописи УДК 544:664.959(043.3) ПОРЦЕЛЬ МАРИЯ НИКОЛАЕВНА РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ХОНДРОИТИНСУЛЬФАТА ИЗ ГИДРОБИОНТОВ БАРЕНЦЕВА МОРЯ И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ 05.18.04 – Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств 02.00.04 – Физическая химия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата технических наук Мурманск – 2011 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Мурманский государственный технический университет» Научные руководители: Кандидат химических наук, Новиков Виталий Юрьевич Кандидат технических наук, профессор Коновалова Ирина Никандровна Официальные оппоненты: Доктор химических наук, профессор Зарембо Виктор ИосифовичКандидат технических наук, доцент Бражная Инна Эдуардовна Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Центр «Биоинженерия» РАН Защита диссертации состоится «3» ноября 2011 г. в 10 час. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д 307.009.02. в Мурманском Государственном техническом университете по адресу: 183010, г. Мурманск, ул. Спортивная, д. 13 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Мурманского государственного технического университета по адресу: 183010, г. Мурманск, ул. Спортивная, д. 13 Отзывы на автореферат направлять по адресу: 183010, г. Мурманск, ул. Спортивная, д. 13, ФГБОУВПО «МГТУ» Автореферат размещен на сайте www.mstu.edu.ru «26» сентября 2011 г. Автореферат разослан «____» сентября 2011 г. Ученый секретарь диссертационного совета канд. техн. наук, профессор И. Н. Коновалова ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Разработка современных технологий переработки гидробионтов является актуальной задачей рыбной отрасли. Создание технологий производства обогащенных пищевых продуктов, профилактических и медицинских препаратов, полученных из морских гидробионтов, включает в себя исследование состава сырья, идентификацию и количественный анализ его компонентов, изучение физико-химических свойств биологически-активных компонентов сырья. Природный полисахарид хондроитинсульфат (ХС), содержащийся в хрящевой ткани, представляет собой сульфатированный гликозаминогликан, макромолекулы которого состоят из чередующихся мономерных звеньев сульфатированного N-ацетил-D-галактозамина (АцГалА) и D-глюкуроновой кислоты (ГлУ). Линейные макромолекулы ХС помогают сделать хрящ более устойчивым к давлению, которое оказывает на него вес тела, принимают участие в формировании костной ткани, связок, а также в поддержании упругости и эластичности стенок кровеносных сосудов. ХС является широко используемой пищевой добавкой для лечения дегенеративно-дистрофических заболеваний суставов и позвоночника, например, артроза и остеохондроза. В настоящее время коммерческие препараты ХС получают главным образом из хрящевой ткани млекопитающих. В последние годы для его производства стали также использовать ткани гидробионтов. Проблемами выделения ХС из различных природных объектов и его применения в медицине и биотехнологии занимаются такие зарубежные ученые как A. Kinoshita,. H. R. Morris, K. Sugahara, M. J. Miller, C. E Costello.; H. Takai,. T. Kono, C. Amornrut, A. B. Khare, S. A. Houliston, F. Abdel и российские исследователи Т. Н. Шкарина, И. М. Сорокоумов и другие. Современные методы получения ХС представляют собой многостадийные процессы экстракции, а выход конечного продукта и его чистота не всегда высоки. Следует отметить, что физико-химические свойства ХС из гидробионтов, методы их идентификации и количественного анализа, количественные закономерности химического гидролиза практически не изучены. В связи с этим, разработка новых и совершенствование известных технологий выделения ХС из морских гидробионтов, изучение их физико-химических свойств, методов идентификации и количественного анализа являются актуальными задачами. Цели работы: изучение содержания и физико-химических свойств ХС гидробионтов Баренцева моря; разработка и совершенствование методов их идентификации и количественного анализа. Разработка технологии получения ХС из гидробионтов. Для достижения поставленных целей решались следующие задачи: 1. Изучение содержания ХС в гидробионтах Баренцева моря: сёмге (Salmo salar), черноротой акуле (Galeus melanostomus), длиннорылой акуле (Deania calceus), полярной акуле (Somniosus microcephalus), северном скате (Amblyraja hyperborean), морском огурце (Cucumaria frondosa). 2. Разработка методики идентификации и количественного анализа ХС из морских гидробионтов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе солей ГалА и D-глюкозамина в продуктах кислотного гидролиза ХС. Совершенствование методик спектрофотометрического определения D-галактозамина (ГалА), АцГалА и ГлУ. 3. Изучение кинетики кислотного гидролиза ХС. Выбор математической модели, адекватно описывающей процесс кислотного гидролиза. 4. Изучение физико-химических свойств водных растворов ХС. 5. Разработка технологии получения ХС с использованием ультрафильтрационных мембран; выбор математической модели, адекватно описывающей технологию получения ХС. 6. Разработка нормативной документации, оценка экономической эффективности технологии получения ХС. Научная новизна Впервые разработана мембранная технология получения ХС из гидробионтов Баренцева моря: сёмги, черноротой акулы, длиннорылой акулы, полярной акулы, северного ската, морского огурца. Разработана методика идентификации и количественного анализа ХС с помощью ВЭЖХ на обращенной фазе. Методика включает определение ГалА и D-глюкозамина в продуктах кислотного гидролиза ХС. Усовершенствованы методики спектрофотометрического определения ГалА, АцГалА и ГлУ. Определены спектральные характеристики, фракционный состав, среднемассовая молекулярная масса, поверхностная и оптическая активность ХС из морских гидробионтов; показано влияние концентрации электролита на процесс полиэлектролитного набухания макромолекул полисахарида. Рассчитаны константы скоростей гидролиза ХС в хлороводородной и серной кислотах. Разработана математическая модель кинетики гидролиза ХС. Предложена методика расчета содержания ХС в исходных объектах с использованием констант скоростей реакции гидролиза ХС. Впервые показана возможность использования системы ХС-ферментный препарат в качестве биомаркера. Практическая значимость Разработана технология получения ХС из гидробионтов Баренцева моря с применением ультрафильтрации. Выделены ХС из хрящевой ткани сёмги, черноротой акулы, длиннорылой акулы, полярной акулы, северного ската, а так же кожных покровов морского огурца. На основании испытаний на базе учебно-экспериментального цеха ФГБОУВПО «МГТУ», (г. Мурманск) разработана и утверждена технологическая инструкция по получению ХС методом ультрафильтрационного разделения, разработаны Технические условия (ТУ) на «Хондроитин сульфат из тканей морских гидробионтов. Полуфабрикат». На базе учебно-экспериментального цеха ФГБОУВПО «МГТУ» изготовлена опытная партия ХС, произведенная в соответствии с разработанной технологической инструкцией. Подана заявка на патент «Способ получения ХС из тканей морских гидробионтов». Основные положения работы, выносимые на защиту: 1. Разработанная технология получения ХС из тканей морских гидробионтов с использованием ультрафильтрационных мембран, имеющих различные молекулярно-массовые пределы задерживания. 2. Разработанные и усовершенствованные методики идентификации и количественного анализа ХС. 3. Результаты изучения закономерностей кислотного гидролиза ХС. 4. Математическая модель кинетики гидролиза ХС, методика расчета содержания ХС в исходных объектах с использованием констант скоростей реакции гидролиза ХС. 5. Результаты изучения физико-химических свойств растворов ХС из тканей морских гидробионтов; возможность применения системы ХС-фермент в качестве биомаркера. 6. Технологическая инструкция на полуфабрикат ХС из тканей морских гидробионтов и ТУ «ХС из тканей морских гидробионтов. Полуфабрикат». 7. Оценка экономической эффективности разработанной технологии. Внедрение результатов исследований На основании проведенных опытно-промышленных испытаний на базе учебно-экспериментального цеха ФГБОУВПО «МГТУ», (г. Мурманск) разработана технологическая инструкция на производство полуфабриката ХС из тканей морских гидробионтов и ТУ «Хондроитинсульфат из тканей морских гидробионтов. Полуфабрикат». Результаты изучения кинетических закономерностей кислотного гидролиза ХС, методики их идентификации и количественного анализа внедрены в учебный процесс для студентов направлений 020100.62 «Химия» и 260100.62 «Технология продуктов питания», специальности 260302.62 «Технология рыбы и рыбных продуктов» и аспирантов, обучающихся по специальности 02.00.04 «Физическая химия». Апробация работы Основные положения диссертационной работы представлены на научно-технических конференциях профессорско-преподавательского состава, аспирантов, научных и инженерных работников МГТУ «Наука и образование» (г. Мурманск, 2008-2011), Международной научной конференции «Инновации в науке и образовании» КГТУ (г. Калининград, 2009-2010), 10-ой международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» на базе Казанского государственного технологического университета (г. Казань, 2009), Всероссийской научно-технической конференции «Современные проблемы экологии» (г. Тула, 2008), международной научно-практической конференции «Техника и технологии переработки гидробионтов и сельскохозяйственного сырья» МГТУ (г. Мурманск, 2008), VIII Всероссийской конференции с международным участием. «Химия и медицина» (Уфа, 2010), 24-th Conference of the European Colloid and Interface Society (Prague, 2010), The 10-th International Conference of the European Chitin Society (г. Санкт-Петербург, 2011). Экспериментальная часть работы выполнена в Мурманском государственном техническом университете в рамках научно-исследовательской работы по госбюджетной теме «Химический и электрохимический гидролиз гидробионтов различной природы» (ГР 01200603803) и Госконтракта № П744. Публикации По теме диссертации опубликовано 17 работ, из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, подана заявка на получение патента (№ 2010153884 (077891)). Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы (161 наименование) и 4 приложений. Работа изложена на 132 страницах, содержит 15 таблиц, 36 рисунков. Содержание работы Введение. Во введении обоснована актуальность работы, сформулированы цель исследования, научная новизна, защищаемые положения. Показана практическая значимость результатов работы. В первой главе «Обзор литературы» приведен анализ отечественной и зарубежной литературы по вопросам строения, свойств, идентификации и применения ХС. Изложены современные технологии получения ХС из тканей млекопитающих и гидробионтов. Во второй главе «Объекты и методы исследования» определены объекты исследования, методы анализа, и порядок статистической обработки экспериментальных данных. ХС получали по описанной в литературе технологии и по разработанной технологии с использованием ультрафильтрации. В качестве сырья были выбраны ткани следующих гидробионтов: сёмга, черноротая акула, длиннорылая акула, полярная акула, северный скат, морской огурец. Спектры поглощения образцов ХС в таблетках KBr регистрировали на инфракрасном спектрофотометре IR-420 (Shimadzu Corp., Япония) в диапазоне частот от 4000 до 400 см-1. Спектры ЯМР получали на спектрометрах Bruker Avance 600 и DRX 500 при 303-306 К после однократной лиофилизации образцов из D2O и последующего растворения их в 99,96 % D2O. Анализ проводился в Институте органической химии им. Н. Д. Зелинского Российской академии наук. Количество АцГалА определяли спектрофотометрическим методом, основанном на образовании окрашенного комплекса АцГалА с п-диметиламинобензальдегидом. Оптическую плотность растворов измеряли на спектрофотометре UV-3101PC (Shimadzu Corp., Япония) при длине волны 585 нм. Содержание восстанавливающих сахаров определяли спектрофотометрическим методом с гексацианоферратом калия. Количество азота определяли методом Кьельдаля на автоматической системе определения общего азота/белка Kjeltec Auto System 1043 (Tecator, Швеция). Количественное определение ХС проводили усовершенствованными методами: спектрофотометрическим методом определения уроновых кислот (расчёт значения оптической плотности по трем точкам) и спектрофотометрическим методом определения ГалА с использованием п-диметиламино-бензальдегида. ГалА, образующийся при полном кислотном гидролизе ХС, определяли разработанным методом с использованием ВЭЖХ на обращенной фазе. Для изучения фракционного состава полученных ХС использовали эксклюзионную ВЭЖХ. Хроматографирование растворов образцов проводили на жидкостном хроматографе LC-10AVP (Shimadzu Corp., Япония) с использованием эксклюзионной колонки TSK-gel Alpha-4000 (30×0,78 см) с предколонкой TSK-guardcolumn Alpha (6×0,4 см) (TOSOH, Япония). Анализ выполняли в лаборатории биохимии и технологии ПИНРО (г. Мурманск). Содержание сульфатов определяли титриметрическим методом (определение неорганического сульфата по ГОСТ 28478-90). Среднемассовую молекулярную массу ХС определяли нефелометрическим методом. Гидродинамический радиус макромолекул оценивали методом дисперсии светорассеяния. Оптическую активность растворов оценивали по углу вращения плоскости поляризации плоско поляризованного света, который измеряли на поляриметре СП-3 (Россия) на длине волны излучения паров натрия. Поверхностную активность водных растворов ХС на границе с воздухом определяли по кривой зависимости поверхностное натяжение-концентрация. Поверхностное натяжение водных растворов определяли методом Вильгельми. Экзогликозидазную активность рассчитывали по выходу восстанавливающих сахаров, образующихся при гидролизе ХС. Содержание восстанавливающих сахаров определяли по реакции с гексацианоферратом калия. В третьей главе «Результаты и их обсуждение» приведены результаты исследований и их обсуждение и разработанная технология получения ХС из гидробионтов методом ультрафильтрации. 1. Разработка и совершенствование методов идентификации ХС По описанной в литературе технологии получения ХС из гидробионтов были выделены ХС из сёмги, черноротой акулы, длиннорылой акулы, полярной акулы, северного ската и морского огурца. Полученные ХС были идентифицированы следующими методами: инфракрасной спектроскопии (ИКС), ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и разработанным методом с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). 1.1. Идентификация ХС методом инфракрасной спектроскопии На рис. 1 приведены инфракрасные спектры поглощения ХС, полученных из морских гидробионтов Баренцева моря (кривые 1-5), в сравнении с литературными данными (кривая 6). На кривой 6 имеются три характерных пика, которым соответствуют частоты 1550, 1350-1300, 1160-1120 см-1, что свидетельствует о соответствии спектров полученных препаратов приведенным в литературе. ИКС даёт возможность определить источник получения ХС по специфическим полосам поглощения – 850 см-1 (ХС-4, преобладающий в сырье из тканей млекопитающих и птиц) или 820 см-1 (ХС-6, характерный для хрящей рыб).  Рис. 1 – Инфракрасные спектры ХС из хрящей: 1 - черноротой акулы; 2 - длиннорылой акулы; 3 - северного ската; 4 - сёмги; 5 - из покровов морского огурца; 6 - литературные данные (сёмга) 1.2. Идентификация ХС методом ЯМР Для образцов ХС были зарегистрированы спектры ЯМР 1Н и 13С. Эти спектры были идентичны для разных образцов по положению сигналов, однако отличались интегральной интенсивностью последних. На рис. 2 приведены спектры ХС из семги, полярной акулы, черноносой акулы, длиннорылой акулы, северного ската.  Рис. 2 – 1Н ЯМР спектры ХС (303-306 K) из (А) семги, (Б) полярной акулы, (В) черноносой акулы, (Г) длиннорылой акулы, (Д) северного ската На основании данных по химическим сдвигам 1Н и 13С ЯМР моносахаридных остатков и внутрициклических КССВ между протонами было установлено, что первая группа сигналов (≈ 4,57/102,4 м.д.) в аномерной области HSQC спектра отвечает остаткам -ГалА, а вторая группа (≈ 4,48/105,4 м.д.) – остаткам ГлУ. Химические сдвиги 1Н и 13С в остатках -ГалА свидетельствовали о том, что они полностью N-ацетилированы и сульфатированы по положениям С6 (большинство остатков) или С4 (минорное количество остатков), что характерно для ХС, полученных из рыб. ЯМР анализ образцов ХС, полученных из исследованных гидробионтов, выявил в их структуре три дисахаридных блока (А, Б и С), которые помимо ацетильной группы могут содержать аминокислотные заместители (в основном глицин), связанные с атомом азота -ГалА. На рис. 3 приведены соответствующие схемы строения.  Рис. 3 – Дисахаридные блоки ХС, полученных из гидробионтов Баренцева моря1.3. Физико-химические свойства растворов ХС В образцах ХС, полученных из морских гидробионтов, были определены среднемассовая молекулярная масса (ММ), поверхностная (G) и оптическая активность ([α]20D) (табл. 1). Таблица 1 Среднемассовая молекулярная масса, оптическая и поверхностная активность ХС
Из данных, приведенных в таблице, следует, что свойства полученных по описанной в литературе технологии препаратов ХС зависят от вида сырья и, по всей видимости, наличия остаточных примесей, например, веществ белковой природы. Изучена экзогликозидазная активность ферментного препарата из гепатопанкреаса камчатского краба с использованием ХС как субстрата. Активность фермента на чистом ХС составляет 7,01×10-4 мкмоль/мин∙мг, на загрязнённом нефтью - 3,65×10-4, ПАВ - 5,37×10-4, при комплексном загрязнении - 2,28×10-4. Полученные результаты показали, что систему ХС (субстрат) - фермент можно использовать в качестве биомаркера. Состояние системы, которое определяется и факторами окружающей среды, может использоваться в качестве показателя биологического состояния организма. 1.4. Идентификация ХС разработанным методом с помощью ВЭЖХ Для качественного определения ХС часто применяется спектрофотометрический метод Дише, основанный на цветной реакции уроновых кислот с карбазолом. ГлУ, входящая в состав ХС, реагирует с карбазолом, образуется розовое окрашивание. Так как почти все виды гликозаминогликанов (гиалуроновая кислота, дерматансульфат, ХС) содержат в своём составе уроновые кислоты, метод Дише не является избирательным, а показывает суммарное содержание гликозаминогликанов. Поэтому для избирательного определения ХС использовали разработанный метод идентификации и количественного анализа ГалА, образующегося при кислотном гидролизе ХС. С помощью ВЭЖХ на обращенной фазе разделяли пики производных ГалА и D-глюкозамина, полученных восстановлением с NaBH4 и последующей реакцией с ортофталевым альдегидом (OPA). Были подобраны соответствующие градиенты и состав буферных растворов. На рис. 4 приведены хроматограммы гидролизата ХС из хрящей сёмги в сравнении с хроматограммами гидролизата хитина, содержащего D-глюкозамин, и смеси аминокислот. Как видно из рис. 4, хроматограммы гидролизатов ХС содержат четкий пик ГалА, что идентифицирует полученный полисахарид как ХС.  Рис. 4 – Хроматограммы гидролизатов полисахаридов: гидролизат хитина (1), гидролизат ХС (2) и смесь аминокислот (3) Подобранные условия хроматографирования позволили полностью разделить пики OPA-производных восстановленных ГалА и D-глюкозамина. Из приведённого графика так же следует, что пики аминокислот не накладываются на пики изучаемых углеводов, что позволяет проводить идентификацию продуктов гидролиза полисахаридов. Количество ГалА в пробе пропорционально площади соответствующего пика на хроматограмме. Таким образом, разработанный метод позволяет определить количество ХС в анализируемой пробе. Разработанный метод может быть применен для анализа других гликозаминогликанов (например, гиалуроновой кислоты), полисахаридов (например, хитина) и сырья, содержащего ХС. Содержание ХС (масса ХС/ масса сухого сырья, %) в изучаемых гидробионтах приведено в таблице 2. Таблица 2 Содержание ХС в сухой обезжиренной хрящевой ткани гидробионтов Баренцева моря
Из данных таблицы следует, что наиболее перспективными видами для получения ХС являются полярная акула и северный скат. Разработанным методом были проанализированы новые пищевые продукты из северного ската (разработка кафедры «Технологий пищевых производств» МГТУ – заливное, запеканка и бульон). Поскольку количественный анализ ХС с помощью разработанного метода ВЭЖХ основан на определении мономерных фрагментов ГалА, были изучены закономерности кислотного гидролиза ХС, полученного из хрящей сёмги. |
Похожие:
 |
Ведущие профессора химия Синтез и изучение физико-химических свойств и строения координационных соединений металлов с N,S,O-содержащими полифункциональными... |
 |
Урок Практическая работа №4 «Получение аммиака и изучение его свойств» Цели урока Цели урока: получения аммиака изучение его свойства через проведение практической работы |
|
Исследование физико-химических свойств промотированных катализаторов на основе Co-Al Южно-Российский государственный политехнический университет имени М. И. Платова Новочеркасск |
|
«Алюминий и его соединения» Обучающая: создать условия для исследования учащимися физических и химических свойств алюминия на основе строения его атома, дальнейшего... |
|
Практическая работа по теме «Получение водорода и изучение его свойств» Цели урока: формирование умений обращения с лабораторным оборудованием, наблюдать, делать выводы, исходя из наблюдений, продолжить... |
|
Контрольные вопросы на государственном экзамене и списки литературы... Водная среда как биотоп гидробионтов. Физико-химические свойства воды. Абиотические, биотические и антропические воздействия на гидробионтов.... |
|
Тематическое планирование по технологии 4 класс Материалы, необходимые для урока технологии. Изучение свойств материалов. Инструменты для урока технологии. Правила безопасной работы... |
|
Влияние физико-химических свойств подземных питьевых вод на здоровье человека Ключевые слова: питьевая вода, жесткость воды, химический состав воды, болезни человека |
|
Группа продуктов Физико-химические и органолептические показатели. (Примечание: при отборе проб на физико-химические показатели и токсичные элементы... |
|
Основные характеристики пломбировочных материалов Правильное использование пломбировочных материалов требует от врача знаний физико-механических и химических свойств имеющихся в ассортименте... |
|
Разработка рецептур и оценка потребительских свойств концентратов... Изучение, анализ и систематизация научно-технической литературы и патентной информации по теме исследования |
|
Ферритин как маркер железодефицитной анемии и опухолевый маркер Андреев Г. И. магистр техники и технологии, выпускник (2003 г.) Спбгпу, факультет медицинской физики и биоинженерии, кафедра физико-химических... |
|
Получение аммиака и изучение его свойств Разноуровневая система деятельности учащихся на практических занятиях в рамках школьного курса химии |
|
Методическая разработка для студентов медицинских колледжей и училищ... Овладение знаниями и умениями по бактериологическому методу исследованию, освоение общих компетенций ок 1, ок 6, 7, 8, ок 12 |
|
И описание профессиональной компетенции Техники должны быть готовы определять оптимальные средства и методы анализа, природных и промышленных материалов; проводить качественный... |
|
Рим Билалович Ахмедов Одолень трава растения против рака Имя Рима Ахмедова широко известно. Делом его жизни стало изучение целительных свойств растительного мира |