Морфофункциональная характеристика мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани человека, культивируемых при пониженном содержании кислорода
|
Скачать 349.82 Kb.
|
|
На правах рукописи РЫЛОВА ЮЛИЯ ВЛАДИМИРОВНА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ИЗ ЖИРОВОЙ ТКАНИ ЧЕЛОВЕКА, КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ПРИ ПОНИЖЕННОМ СОДЕРЖАНИИ КИСЛОРОДА 03.03.01 - физиология 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2013 Работа выполнена в Федеральном Государственном бюджетном учреждении Государственном научном центре Российской Федерации – Институте медико-биологических проблем Российской академии наук Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН Буравкова Людмила Борисовна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор, зав. лабораторией «Протеомики» отдела «Молекулярно-клеточной биомедицины» ГНЦ РФ – ИМБП РАН Ларина Ирина Михайловна доктор медицинских наук, профессор, заместитель директора Института, зав. лабораторией «Энергетики биологических систем» Института Теоретической и Экспериментальной Биофизики РАН Маевский Евгений Ильич Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии РАМН» Защита диссертации состоится «___» _________ 2013 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 002.111.01 в Федеральном Государственном бюджетном учреждении Государственном научном центре Российской Федерации – Институте медико-биологических проблем Российской академии наук (ГНЦ РФ – ИМБП РАН) по адресу: 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76 а. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ – ИМБП РАН Автореферат разослан «___» __________ 2013 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук М.А. Левинских ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) были открыты почти 40 лет назад в лаборатории А.Я. Фриденштейна (Фриденштейн, Лурия, 1980) при анализе клеточных популяций костного мозга по способности формировать колонии фибробластоподобных клеток и по аналогии с гемопоэтическими стволовыми были названы КОЕ-ф (колониеобразующие единицы фибробластов). В настоящее время ученые многих стран обнаружили высокую пластичность этих предшественников, заключающуюся в способности дифференцироваться в клетки разных типов тканей взрослого организма, а также выяснили, что они присутствуют не только в костном мозге. Близкие по свойствам к ММСК клетки выделены из целого ряда тканей и органов, таких как жировая ткань, синовиальная жидкость, скелетные мышцы, легкие, Вартоновский студень пупочного канатика, периодонтальные связки, пульпа зуба и др. (Caplan, 1991; Crisan et al., 2008; Da Silva Meirelles et al., 2006; Fraser et al., 2006; Griffiths et al., 2005; Beltrami et. al., 2003; Josse et al., 2010), что свидетельствует о широком распространении их в организме как тканеспецифичного резерва малодифференцированных мезенхимальных клеток, которые способствуют поддержанию и регенерации этих тканей. Хорошо известны такие свойства ММСК in vitro, как, например, дифференцировка в клетки различных тканей мезенхимального происхождения, (Clarke et al., 2000; Zuk et. al., 2002; Gimble et al., 2008), однако существует мало информации относительно естественного распределения и биологии этих клеток в организме, а также возможных изменений их свойств в процессе экспансии in vitro. Внедрение клеточных технологий, основанных на использовании уникальных свойств ММСК, в клиническую практику является актуальной задачей современной медицины и требует проведения многочисленных исследований. При этом быстро развивающиеся технологии предоставляют широкие возможности для контролируемого изменения параметров культивирования различных типов клеток. Однако чаще всего эти изменения касаются химических компонентов ростовой среды (содержание питательных веществ, факторов роста, солей и аминокислот). Газовый состав традиционно остается наиболее консервативным параметром при культивировании, при этом уровень СО2 приближается к тканевому, тогда как содержание кислорода в обычных СО2–инкубаторах соответствует содержанию кислорода в воздухе (около 20%). Вопрос о том, какая концентрация кислорода является физиологической для клеток in vitro, активно обсуждается в научной литературе. В связи с этим предпринимаются попытки изучения состояния культивируемых клеток при различном содержании кислорода (Cooper et. al., 1999; Das et. al., 2001; Bosch et.al., 2006; Grayson et. al., 2006; Буравкова, Анохина, 2007; Буравкова и др., 2009). Однако нет единого мнения о том, какую концентрацию кислорода надо использовать, какое время клетки должны подвергаться воздействию измененного содержания кислорода, как при этом следует учитывать такие факторы, как состав среды, плотность субкультивирования клеток и др. Высказываются предположения, что физиологическое содержание кислорода (около 4%-7%) будет оптимальным для культивируемых клеток (Буравкова и др., 2009; Fehrer et. al., 2007), а более низкий уровень приведет к гипоксическому состоянию. Особый интерес исследователей к ММСК, как наиболее перспективному клеточному элементу для тканевой инженерии и восстановительной медицины, диктует необходимость проведения исследований, посвященных оценке функционального состояния ММСК в процессе их экспансии ex vivo, а также оптимизации процесса культивирования с целью приближения к условиям физиологического микроокружения этих клеток. Цель и задачи исследования Целью данной работы является оценка влияния различного процентного содержания кислорода на морфофункциональное состояние мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани. В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи: Задачи исследования:
8. Исследовать влияние газовой среды с различным содержанием кислорода (20% и 5% О2) на уровень дифференциальной экспрессии генов ММСК. Научная новизна Впервые проанализировано влияние постоянного воздействия различного содержания кислорода (20%, 5%, 3%, 1%) на метаболизм глюкозы и морфофункциональное состояние ММСК, а также проведен сравнительный анализ дифференциальной экспрессии генов при различном содержании кислорода в среде культивирования. Впервые установлено, что снижение гетерогенности популяции ММСК и увеличение в ней доли веретенообразных клеток при культивировании в условиях пониженного содержания кислорода (5%-1% О2) сопровождается изменением экспрессии генов таких структурных и регуляторных белков цитоскелета как, β-тубулин, супервиллин, анкерин, тропомиозин, актинин, кальпонин, эффекторные белки Rho-ГТФазы, трансгелин и саркогликан-γ. Получены новые данные, свидетельствующие о стимулирующем эффекте пониженного содержания кислорода в среде (5% О2) на пролиферацию ММСК, что соотносится с изменением экспрессии регуляторов клеточного цикла (белки семейства Fos, формирующие транскрипционный фактор AP1, ядерный антиген пролиферирующих клеток, циклин D2, регуляторная единица циклин-зависимой киназы и ингибитор циклин-зависимой киназы). Впервые показано, что культивирование ММСК при пониженной концентрации кислорода приводит к уменьшению потребления глюкозы клетками и увеличению молярного соотношения продуцируемого лактата и потребляемой глюкозы, что сопровождается снижением трансмембранного потенциала митохондрий и увеличением экспрессии генов, кодирующих все ферменты гликолитического расщепления глюкозы. Впервые продемонстрирована обратимость изменений, вызванных пониженной концентрацией кислорода в среде, заключающаяся в восстановлении остеогенного дифференцировочного потенциала, уменьшении пролиферативной активности ММСК и способности к формированию КОЕ-ф. Теоретическая и практическая значимость работы Проведенное исследование позволило продемонстрировать, что содержание кислорода в среде культивирования может быть использовано как фактор, модулирующий свойства ММСК, что имеет большое значение для дальнейших фундаментальных и прикладных исследований в области физиологии прогениторных клеток. Представленные результаты вносят существенный вклад в изучение основных механизмов вовлечения ММСК в процессы репарации с учетом специфики их локального микроокружения. Полученные в настоящей работе данные показали, что использование низкого парциального давления в среде культивирования позволяет в 2-3 раза увеличить прирост клеточной массы по сравнению с условиями стандартного содержания кислорода в среде культивирования (20% О2). Получен патент на изобретение № 2418066 от 26.04.2010. Данные настоящего исследования демонстрируют возможность поддержания недифференцированного статуса активно пролиферирующей популяции ММСК в условиях пониженного содержания кислорода, что может иметь большое значение для использования в тканевой инженерии и регенеративной медицине. Положения, выносимые на защиту
Апробация работы Основные результаты и положения диссертации доложены и обсуждены на: 8-й – 10-й конференциях молодых ученых и специалистов, аспирантов и студентов, посвященных Дню космонавтики (Москва, 2009 - 2011); 6-й Всероссийской конференции с международным участием “Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция” (Москва, 2011); 7-й Международной конференции “Молекулярная генетика соматических клеток” (Звенигород, 2009); Всероссийской научной школе по биомедицинской инженерии «БМИ – 2010» (Санкт-Петербург, 2010); Всероссийской научной школе-конференции для молодежи «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» (Москва, 2009); 4-й Всероссийской научной школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2011); XXI съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Калуга, 2010); French-Russian-Belarussian Conference «Neurovascular impairment induced by environmental conditions: molecular, cellular and functional approach» (Angers, France, 2010); 2nd International Conference on Medical Physiology «Recent researches in modern medicine» (Cambridge, UK, 2011); World Conference on Regenerative Medicine (Leipzig, Germany, 2011). По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах из перечня ВАК РФ. Работа выполнена при поддержке программы поддержке программы ОБН РАН и гранта Минобрнауки РФ № 11.G34.31.0006. Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ – ИМБП РАН “Космическая физиология и биология” 24.10.2012 г. Структура и объем диссертации Диссертация состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы» и «Список литературы». Текст диссертации изложен на 166 страницах машинописного текста, сопровождается 39 рисунками и 13 таблицами. Список литературы содержит 371 источника, из них 34 на русском и 337 на иностранном языке. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований Получение и культивирование ММСК. Для получения первичной культуры использовали метод ферментативной обработки стромально-васкулярной фракции (СВФ) жировой ткани человека (Zuk et al., 2001, Буравкова и др., 2009). Культивирование клеток осуществляли в среде α-MEM (MP Biomedicals, США) с добавлением 2 мМ глутамина (ПанЭко, Россия), 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (ПанЭко, Россия), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Hyclone, США). Плотность посадки клеток составляла 3 х 103 клеток/см2. Стандартное культивирование проводили при 37оС в атмосфере 5% СО2 с использованием СО2-инкубатора (Sanyo, Япония). Для создания пониженного содержания кислорода в среде использовали мультигазовый инкубатор (Sanyo, Япония) (5% О2) и герметичную камеру (Stem Cell Technologies, США), модифицированную датчиками давления и концентрации О2, которую продували газовой смесью (95% N2, 5% СО2) до установления 1% и 3% концентрации кислорода. В работе использовали клетки 1-8 пассажа. Каждый эксперимент воспроизводился 3-6 раз с дублированием аналитических измерений. Характеристика ММСК. Оценку морфологии ММСК и подсчет клеток для определения их прироста проводили с помощью программы Sigma ScanPro 5 при анализе фотографий случайно выбранных полей зрения, полученных с использованием светового фазово-контрастного микроскопа Leica DM IL, оснащенного системой анализа изображения DC420 (Leica, Германия). Число удвоений популяций (PD) подсчитывали по формуле PD = log2N/No, где No и N – начальное и конечное количество клеток (Wolfrom С., Raynaud N., Maigne J., 1994). Время удвоения популяции (TD) определяли по формуле TD = (log22) * t/[log2(N/N0)], где t – время прироста популяции, N – количество клеток через время t, N0 – исходное количество клеток (Романов, 2011). Способность ММСК формировать колонии в процессе культивирования на разных пассажах оценивали методом, описанным в работе А.И. Фриденштейна и сотрудников (1987). В чашки Петри (Ø 60 мм) высевали по 50 клеток и культивировали в ростовой среде. Через 14-15 дней культуры окрашивали 0,5% раствором кристаллвиолета в метаноле в течение 5 мин. (Фриденштейн и др., 1967). Иммунофенотип клеток оценивали по экспрессии ряда поверхностных маркеров с помощью моноклональных антител (Immunotec, Франция), меченых FITC (HLA-ABC, CD9, CD90, CD106, CD54, CD31, CD117) и PE (CD34, CD54, CD73, CD105, CD62L, CD62P, CD62E), на проточном цитофлуориметре Epics XL (Beckman Coulter, США). В качестве контроля использовали неиммунные меченые FITC и PE моноклональные антитела (Immunotec, Франция) того же изотипа, что и антитела против исследуемого маркера. Жизнеспособность ММСК оценивали по количеству апоптотических и некротических клеток методом проточной цитофлуориметрии с помощью набора ANNEXIN V-FITC Kit (Immunotech, Франция) согласно инструкции производителя. Индукцию дифференцировки осуществляли с помощью остеогенных (10-8 М дексаметазона, 10 мМ глицерол-2-фосфата (Sigma, США) и 0,2 мМ 2-фосфо-L-аскорбиновой кислоты (Fluka, Германия)) и адипогенных (0,5 мМ изобутилметилксантина, 1 μМ дексаметазона (Sigma, США), 10 μг/мл инсулина (NovoNordisk, Дания), 200 μМ индометацина (Sigma, США)) дифференцировочных стимулов. Выявление щелочной фосфатазы проводили с помощью набора Alkaline Phosphatase Kit (Sigma-Aldrich, США). Выявление минерализованных компонентов матрикса проводили, окрашивая культуры клеток ализариновым красным (Sigma, США). Коммитирование ММСК в адипогенном направлении оценивали по появлению клеток, накапливающих в цитоплазме липидные капли, выявляемые с помощью красителя Oil Red (Sigma, США). Концентрацию лактата и глюкозы в среде определяли ферментативным колориметрическим методом, согласно инструкции производителя наборов (Biocon, Германия) на спектрофотометре Eppendorf (Германия) и затем пересчитывали на 1 клетку по формуле:
где [ΔMet] величина, на которую изменилась концентрация глюкозы/лактата в среде за 24 часа и Xv среднее количество клеток в данный момент времени. Молярное соотношение продуцируемого лактата и потребляемой глюкозы (YLa/Glu) рассчитывали как соотношение qLa /qGlu. Выявление и оценку функционального состояния митохондрий в ММСК проводили с помощью флуоресцентного красителя MitoTracker Red 580 (Invitrogen, США). Исследование дифференциальной экспрессии генов проводили в ММСК подвергавшихся 96 часовой экспозиции, а также при постоянном культивировании в условиях 20% и 5% содержания О2. Результаты уровня экспрессии генов ММСК, полученные с помощью набора HumanRef-8 (Illumina, США) сотрудниками фирмы ООО «Геноаналитика» анализировали с помощью базы данных http://www.ncbi.nlm.nih.gov. |
vПохожие:
 |
Протокола Определение: Хроническое рецидивирующее заболевание, проявляющееся избыточным накоплением жировой ткани и является следствием дисбаланса... |
|
Сравнительная характеристика натуральных киллерных клеток человека в норме и при раке легкого Работа выполнена в Республиканском государственном предприятии «Институт молекулярной биологии и биохимии им. М. А. Айтхожина» Комитета... |
|
Мясо, мясопродукты играют важную роль в питании человека, вследствие... В состав мяса помимо собственно скелетных мышц входят также элементы соединительной, жировой, нервной ткани, а в так называемое товарное... |
 |
Комплекс мониторный кардио-респираторной системы и гидрации тканей,... Комплекс мониторный кардио-респираторной системы и гидрации тканей, компьютеризированный для анализа внутренних сред организма (процентное... |
|
На поставку Анализатора кислорода акпм-1-12ГМ Время установления 95% показаний при скачкообразном изменении концентрации кислорода при 25 oС, с, не более |
|
Концентратор кислорода Является полноценным пятилитровиком, то есть его максимальная производительность при высокой концентрации кислорода – до 5 л/мин |
|
Концентратор кислорода Является полноценным пятилитровиком, то есть его максимальная производительность при высокой концентрации кислорода – до 5 л/мин.... |
|
Настоящее руководство по эксплуатации предназначено для изучения... Чных продуктов горения, в том числе оксида углерода, химически опасных веществ и аэрозолей в виде дыма, пыли и тумана, образующихся... |
|
Инструкция по установке и эксплуатации рулонных штор. Прочтите инструкцию... Крепление ткани к трубе производится двухсторонним скотчем, поэтому при эксплуатации нельзя полностью разматывать полотно 1,5 оборота... |
|
Быть иди не быть кислородному коктейлю в детских садах? При контакте кислорода с жидкостью (с возможным добавлением фруктовых сиропов, настоев лекарственных трав) создается обильная пена,... |
|
Правила пользования газом в части обеспечения безопасности при использовании... Постановление Правительства РФ от 14 мая 2013 г. N 410 "О мерах по обеспечению безопасности при использовании и содержании внутридомового... |
|
Инструкция к вышивке «Перец-светофор» Необходимые материалы: кусок белой канвы Аида 18 (7,25 клеток на см) размером 5160 см, игла вышивальная, маркер для ткани, схема,... |
|
Габаритные размеры, мм, не более Противогаз шланговый пш-1 – воздухо-напорный прибор изолирующего типа предназначен для защиты органов дыхания и зрения человека в... |
|
Доклад о деятельности Уполномоченного по правам человека в Приморском крае в 2013 году Статистическая и социологическая характеристика обращений граждан к Уполномоченному по правам человека |
|
Карта-инструкция Практическая работа №5 «Получение и свойства кислорода» Цель работы: научить использовать лабораторное оборудование и посуду для получения, собирания и доказательства наличия кислорода,... |
|
Инструкция по криоконсервированию клеток крови введение для долгосрочного... Эти методы позволяют длительно (годами) сохранять клетки в жизнеспособном и функционально полноценном состоянии и после размораживания... |