10 куб. см приготовленного раствора переносят пипеткой в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, прибавляют 10 куб. см йодистого калия и 20 куб. см серной кислоты, перемешивают, закрывают колбу пробкой и ставят в темное место.
Через 5 мин. титруют выделившийся йод до обесцвечивания раствора.
6.6.4. Обработка результатов.
Массовую долю активного хлора (Х) в процентах вычисляют по формуле:
V х 0,0035453 х А х 100
Х = -----------------------,
m Б
где:
V - объем 0,1 н раствора серноватистокислого натрия, израсходованный на титрование анализируемой пробы, куб. см;
0,0035453 - масса активного хлора, соответствующая 1 куб. см 0,1 н раствора серноватистокислого натрия, г;
А - исходный объем приготовленного раствора, куб. см;
m - масса навески препарата, г;
Б - масса раствора, взятого для титрования, куб. см.
За результат анализа принимают среднее арифметическое двух параллельных определений, допускаемые расхождения между которыми не должны превышать 0,3%.
7. Приготовление нейтрализующих растворов
Нейтрализующие растворы готовят в концентрации в 10 раз меньше, чем концентрация использованного дезинфицирующего средства.
Раствор делают на стерильной воде в стерильной посуде и разливают в пробирки или флаконы с соблюдением правил стерильности (растворы уксусной кислоты и бикарбоната натрия можно стерилизовать автоклавированием). Раствор аммиака стерилизации не подлежит. Готовые пробирки (флаконы) можно хранить в течение пяти дней при комнатной температуре.
8. Приготовление тампонов
Ватные или марлевые тампоны для взятия смывов монтируют на алюминиевой проволоке, пропущенной через резиновую пробку. В пробирки разливают по 10 мл физиологического раствора, закрывают резиновыми пробками с вмонтированными тампонами и автоклавируют при 1 атм. в течение 30 мин.
9. Подготовка материалов для исследования методом отпечатков
9.1. Подготовка предметных стекол.
Для исследования используют предметные стекла (размером 2,5 х 7,5 см) или стекла, разрезанные вдоль на две половинки (1,2 х 7,5 см). Стекла предварительно кипятят 10 - 15 мин. в 2 - 5%-ном растворе моющего порошка ("Лотос", "Новость" и т.п.). Затем поверхность предметных стекол с двух сторон натирают с помощью зубной щетки или ерша этим же порошком, слегка увлажненным водой, после чего тщательно промывают в проточной воде, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Подготовленные стекла хранят в банке с притертой крышкой в сухом виде.
9.2. Обработка ванн и пробирок, предназначенных для транспортировки, хранения и инкубирования проб-отпечатков.
При взятии проб на широкие стекла используют пластмассовые ванны для окраски мазков крови на предметном стекле (ТУ 64-1), на узкие - бактериологические пробирки, закрытые резиновыми пробками.
Пластмассовые ванны разбирают и тщательно моют горячим мыльным раствором, после чего ополаскивают вначале водопроводной водой, затем 70%-ным этиловым спиртом или кипящей дистиллированной водой и обрабатывают 2 ч ультрафиолетовыми лучами. На дно подготовленной ванны помешают стерильную фильтровальную бумагу, затем ванны собирают и закрывают крышками.
Бактериологические пробирки и резиновые пробки моют и стерилизуют общепринятым способом. Перед стерилизацией на дно пробирки помещают небольшой ватный тампон.
9.3. Подготовка предметных стекол со средой.
В стерильном боксе на предметные стекла наносят тонкий слой расплавленной питательной среды: для выделения группы бактерий кишечной палочки используют агар Эндо, стафилококков - 8,5%-ный солевой мясопептонный агар (рН 7,2 - 7,4). Количество нанесенной среды должно соответствовать 0,15 мл (четыре капли) для узкого предметного стекла и 0,33 мл (восемь капель) для широкого.
Перед нанесением на стекло среду, находящуюся в пробирках, ставят в водяную баню и расплавляют. Затем в нее погружают стерильную пастеровскую пипетку. Температуру воды в бане поддерживают в пределах 80 - 90 °С.
Прогретые над пламенем горелки предметные стекла (берут корнцангом) раскладывают на ровной, строго горизонтальной поверхности стола. На них пипеткой наносят указанное количество питательной среды, отступив на 2 - 2,5 см от поперечного края стекла. Затем, расположив горизонтально пастеровскую пипетку, питательную среду быстро распределяют по средней трети поверхности стекла и подсушивают при комнатной температуре до появления вокруг питательной среды высушенной полосы шириной 0,5 - 1 мм. Широкие стекла со средой помещают в пластмассовые ванны, узкие - в пробирки.
Ванны и пробирки предварительно увлажняют путем внесения на дно 1 мл, 0,1 мл стерильной водопроводной воды соответственно.
Для удобства транспортировки ванны устанавливают в бюксы, пробирки - в металлические пеналы или в специально приспособленную сумку.
Подготовленные предметные стекла с солевым агаром хранят при температуре 4 °С до десяти суток, со средой Эндо - двое-трое суток (если нет видимого изменения цвета среды).
10. Подготовка стекол для микрокультивирования микобактерий
Предметные стекла разрезают вдоль на узкие полоски размером 1,2 х 7,5 см, моют и помещают на 2 ч в хромпик (40 г двухромовокислого калия высыпают в фарфоровую кружку или эксикатор и растворяют в небольшом количестве воды, затем осторожно добавляют концентрированную серную кислоту до общего объема 1 л).
После хромпика стекла вновь моют дистиллированной водой, протирают чистой льняной тканью, стерилизуют сухим жаром (160 °С) 2 ч и хранят в закрытых сосудах (эксикаторах).
11. Приготовление питательных сред
11.1. Среды для выделения кишечной палочки.
11.1.1. Модифицированная среда Хейфеца.
К 1 л дистиллированной воды добавляют 10 г пептона, 5 г хлорида натрия и 4 г лактозы. Смесь доводят до кипения, затем фильтруют и после остывания определяют рН, который должен быть 7,4 - 7,8. Затем к среде добавляют в качестве индикатора 1 мл 5%-ного спиртового раствора розоловой кислоты и 2,3 мл 0,1%-ного водного раствора метиленовой сини. Среду разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм. 15 мин. Исходный цвет среды - красновато-сиреневый.
11.1.2. Питательная среда КОДА сухая.
Состав и способ приготовления приведены в этикетке на упаковке среды.
11.2. Среды для выделения стафилококка.
11.2.1. Солевой мясопептонный бульон. К обычному МПБ с рН 7,2 - 7,4 добавляют 6,5% натрия хлорида х.ч. или ч.д.а., перемешивают до полного растворения соли, разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют при 1 атм. 20 - 30 мин.
11.2.2. Солевой мясопептонный агар.
К расплавленному МПА добавляют 8,5% натрия хлорида х.ч. или ч.д.а., перемешивают до полного растворения соли, разливают в колбы и стерилизуют при 1 атм. 20 - 30 мин. Перед использованием солевой агар разливают в стерильные бактериологические чашки по 10 - 15 см. После застывания среду подсушивают в термостате 1 ч.
11.3. Дифференциально-диагностическая среда для индикации Bac. anthracis.
11.3.1. Приготовление растворов ингредиентов.
Полимиксина М сульфат во флаконе растворяют в стерильной дистиллированной воде, а затем последовательными разведениями стерильным 0,9%-ным раствором натрия хлорида доводят до концентрации 10000 ЕД/мл.
Невиграмон переносят в стеклянный флакон или пробирку и растворяют в 25%-ном водном растворе аммиака при тщательном перемешивании стеклянной палочкой. Затем последовательно разводят стерильным 0,9%-ным раствором натрия хлорида до концентрации 100 мкг/мл.
Моющее средство "Прогресс" растворяют стерильной дистиллированной водой до 0,1%-ной концентрации.
Гризеофульвин (в таблетках) тщательно растирают в ступке, затем растворяют в стерильной дистиллированной воде до содержания 100 мкг препарата в 1 мл.
Фенолфталеинфосфат натрия (заводской 10%-ный раствор) стерилизуют 30 мин. на водяной бане при 56 °С.
11.3.2. Приготовление дифференциально-диагностической среды.
100 мл питательного агара (в колбах) расплавляют в кипящей водяной бане и охлаждают до температуры 45 - 50 °С. Затем в агар добавляют 0,5 мл полимиксина М сульфата, столько же невиграмона, гризеофульвина <*>, такое же количество моющего средства "Прогресс" и 0,1 мл фенолфталеинфосфата натрия.
--------------------------------
<*> Гризеофульвин добавляют в среду при подозрении на загрязнение материала грибами.
После перемешивания среду разливают в чашки Петри (крышки открыты) и подсушивают 1,5 - 2 ч. Дифференциально-диагностическую среду после разлива можно хранить в холодильнике в течение одних-двух суток.
Готовую дифференциально-диагностическую среду выпускает Ставропольская научно-исследовательская ветеринарная станция (355100, г. Ставрополь, ул. Биологическая, 20).
11.4. Среда Сотона для выделения микобактерий.
В 940 мл дистиллированной воды растворяют 4 г аспарагина, 2 - лимонной кислоты, 0,5 - кали фосфорнокислого двузамещенного, 0,5 - сернокислой магнезии и 0,05 г лимоннокислого аммиачного железа. Затем добавляют 60 мл нейтрального глицерина. После полного растворения аспарагина и солей рН среды должен быть 7,4. Среду разливают по 200 мл в колбы вместимостью 250 мл и стерилизуют 30 мин. в автоклаве при 1,5 атм.
Перед использованием в колбу со средой Сотона добавляют 30 мл стерильной сыворотки крови крупного рогатого скота и разливают в стерильные пробирки по 7 - 8 мл.
12. Приготовление индикаторных пробирок для контроля качества дезинфекции аэрозолями формальдегида
Индикаторные пробирки - это стеклянные трубки диаметром 4 - 8 мм и длиной 40 - 50 мм. В качестве таких пробирок могут быть использованы пробирки Уленгута или отрезки пастеровских пипеток, запаянные с одного конца. Пробирки заливают расплавленной индикаторной средой до уровня обреза пробирок, запечатывают парафином и хранят 1 мес. (со дня изготовления) при температуре 0 - 5 °С.
Для учета результатов без линейки на индикаторные пробирки при их изготовлении можно нанести две риски на расстоянии 18 и 30 мм от среза пробирки.
Для экспресс-метода контроля качества аэрозольной дезинфекции помещений используют среду Эндо, выпускаемую биологической промышленностью в сухом виде; 2%-ную взвесь сухой среды в дистиллированной воде доводят до кипения и пропускают через ватный фильтр, после чего среду заливают в пробирки при помощи пипеток.
13. Подготовка тест-объектов для контроля качества дезинфекции спецодежды
В качестве тест-культур используют музейные штаммы кишечной палочки (E. coli - штамм 1257), золотистого стафилококка (St. aureus - штамм 209-F) и Bac. cereus - штамм 96.
Музейные культуры (после лиофильной сушки) хранят при температуре минус 4 °С не более двух лет, в виде посевов на МПА (посев уколом) под слоем стерильного вазелинового масла (толщина слоя 1,5 - 3 мм) не более шести месяцев.
Батистовую ткань стирают, гладят, нарезают на кусочки размером 5 х 10 мм, которые раскладывают по 50 шт. в чашки Петри. Чашки завертывают в плотную бумагу и стерилизуют 30 мин. в автоклаве при температуре 110 °С (0,5 атм.).
Стерильные тест-объекты в той же чашке Петри заливают смесью 2 млрд. взвеси тест-культуры и инактивированной сыворотки крови (или 40 - 50%-ной эмульсии кала животных), взятых в соотношении 1:1 (из расчета 1 мл на 1 тест-объект). Чашку Петри закрывают крышкой и оставляют при комнатной температуре на 20 мин. Затем тест-объекты переносят в другую чашку Петри на поверхность стерильной фильтровальной бумаги, положенной в два слоя на дно чашки, покрывают сверху листом стерильной фильтровальной бумаги, чашку закрывают крышкой. Через 10 мин. тест-объекты переносят на поверхность листа стерильной фильтровальной бумаги в чашке Петри, подсушивают 20 - 30 мин. в термостате при 37 °С.
Приложение 4
МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА АНОЛИТА
1. Качество анолита контролируют по концентрации активного хлора в анолите и величине рН.
2. Определение концентрации активного хлора в анолите проводят йодометрически по количеству гипосульфита, израсходованного на связывание свободного йода, вытесненного из йодистого калия активным хлором.
Для этого 10 мл раствора переносят в коническую или круглую плоскодонную колбу емкостью 100 мл. Добавляют пипеткой 10 мл 10%-ного раствора йодистого калия и 1,5 мл 25%-ной серной кислоты. Раствор ставят на 10 мин. в темное место, после чего оттитровывают 0,1 н раствором гипосульфита выделившийся йод с крахмалом в качестве индикатора.
Содержание активного хлора в процентах вычисляют по формуле:
0,00355 х А х 100 х К
Х = ---------------------,
10
где:
0,00355 - грамм-эквивалент хлора, соответствующий 1 мл 0,1 н раствора гипосульфита;
А - количество, мл, раствора гипосульфита, пошедшего на титрование;
100 - множитель для пересчета результатов в %, или 1000 - для пересчета содержания активного хлора в мг/л;
К - коэффициент поправки раствора гипосульфита (при приготовлении из фиксанала К = 1);
10 - объем анализируемого раствора, мл.
За результат анализа принимают среднее арифметическое двух параллельных определений.
3. Определение величины рН анолита (и католита) проводят с использованием ионометра И-120.1 или ЭВ-74, или рН-150 в соответствии с инструкцией прибора.
|
