ТЕМА 3.
Выделение, очистка и определение гомогенности белков.
Указания к изучению темы.
Индивидуальные белки различаются по своим физико-химическим свойствам: форме молекул, молекулярной массе, суммарному заряду молекулы, соотношению полярных и неполярных групп на поверхности молекулы белка, растворимости белков, а также степени устойчивости к воздействию денатурирующих агентов.
Белки - высокомолекулярные соединения, однако сильно отличаются по молекулярной массе, которая колеблется от 6000 до 1 000 000 Д и выше. По форме молекул белки делят на глобулярные и фибриллярные. Суммарный заряд белковой молекулы зависит от соотношения ионизированных анионных радикалов Глу и Асп и катионных радикалов Лиз, Apr и Гис. Значение рН, при котором белок приобретает суммарный нулевой заряд, называют "изоэлектрическая точка" и обозначают как pI. В изоэлектрической точке количество положительно и отрицательно заряженных групп белка одинаково. Белки, имеющие суммарный положительный или отрицательный заряд, лучше растворимы, чем белки, находящиеся в изоэлектрической точке. Растворимость белков в воде зависит от всех перечисленных выше свойств белков: формы, молекулярной массы, величины заряда, соотношения полярных и неполярных функциональных групп на поверхности белка. Кроме этого, растворимость белка определяется составом растворителя, т.е. наличием в растворе других растворённых веществ.
Для подробного исследования физико-химических и биологических свойств белков, а также для изучения их химического состава и структуры непременным условием является получение белков из природных источников в химически чистом, гомогенном состоянии.
Получение индивидуальных белков из биологического материала (тканей, органов, клеточных культур) требует проведения последовательных операций, включающих:
дробление биологического материала и разрушение клеточных мембран;
фракционирование органелл, содержащих те или иные белки;
экстракцию белков (перевод их в растворённое состояние);
разделение смеси белков на индивидуальные белки.
Белки весьма чувствительны к повышению температуры и действию многих химических реагентов. Поэтому обычные методы органической химии, применяемые для выделения того или иного вещества из смеси, неприемлемы для белков. Белки в этих условиях подвергаются денатурации, т.е.теряют существенные природные (нативные) свойства, в частности растворимость и биологическую активность. Биохимиками разработаны эффективные методы выделения белков в «мягких» условиях, при низкой температуре, с применением щадящих нативную структуру химических реагентов.
Перед выделением белков из биологических объектов (органы и ткани животных, микроорганизмы, растения) исследуемый материал тщательно измельчают до гомогенного состояния. Для разрушения биологического материала используют метод попеременного замораживания и оттаивания, обработку клеток ультразвуком и метод «азотной бомбы», при котором клетки (в частности, микробные) сначала насыщают азотом под высоким давлением, затем резко сбрасывают давление – выделяющийся газообразный азот как бы разрывает «оболочку» клетки.
Измельчение тканей обычно сочетают с одновременной экстракцией белков из гомогенатов тканей. Большинство белков тканей хорошо растворимо в 8–10% растворах солей. При выделении белков широко применяют различные буферные смеси с определенными значениями рН среды, органические растворители, а также неионные детергенты – вещества, разрушающие гидрофобные взаимодействия между белками и липидами и между белковыми молекулами.
После разрушения ткани нерастворимые части осаждают центрифугированием. Центрифугирование гомогената с разной скоростью позволяет получить отдельные фракции, содержащие клеточные ядра, митохондрии и другие органеллы, а также надосадочную жидкость, в которой находятся растворимые белки. Нуклеиновые кислоты, липиды и другие небелковые вещества можно удалить из раствора, используя их особые физико-химические свойства.
После получения растворов, содержащих смесь белков приступают к разделению – фракционированию смеси белков на индивидуальные белки. Для этого применяют разнообразные методы: высаливание, тепловую денатурацию, осаждение органическими растворителями, хроматографию, электрофорез, распределение в двухфазных системах, кристаллизацию.
Применение в определенной последовательности ряда перечисленных методов позволяет получить белок в очищенном состоянии, содержащий, однако, некоторые низкомолекулярные примеси. Для полного освобождения белков от этих примесей используют методы диализа, гель-хроматографии, кристаллизации, ультрафильтрации.
На заключительных стадиях выделения и очистки белков биохимиков интересует вопрос о гомогенности полученного белка. Нельзя оценивать гомогенность индивидуального белка только по одному какому-либо физико-химическому показателю. Для этого необходимо использовать разныме критерии. Наиболее достоверные результаты при определении гомогенности белка дают ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы или хлорида цезия, диск-электрофорез в полиакриламидном геле, изоэлектрическое фокусирование, иммунохимические методы и определение растворимости белка.
Литература к теме 3:
Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. 3-е изд., Москва : Медицина, 2007.
Николаев, А. Я. Биологическая химия : учеб. / А. Я. Николаев. – 3-е изд., перераб. и доп. – М., 2007.
Северин Е.С., Николаев А.Я. Биохимия : краткий курс с упражнениями и задачами. 3-е изд., Москва : ГЭОТАР-МЕД, 2005.
Биохимия: Учеб. для вузов / Под ред. Е.С. Северина, Москва : ГЭОТАР-МЕД, 2003.
Мюльберг, А. А. Фолдинг белка : учеб. пособие / А. А. Мюльберг. – СПб. : Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2004.
Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: МЦНМО, 2002.
Эллиот, В. Биохимия и молекулярная биология / В. Эллиот, Д. Эллиот ; под ред. А. И Арчакова, М. П. Кирпичникова, А. Е. Медведева, В. П. Скулачева. – М., 2002.
Elliott. – Oxford : University Press, 2002.
Вавилова Т.П.,Евстафьева О.Л.,Островская И.Г. Практикум по биохимии. М.: Веди. 2009.
Сова В.В.,Кусайкин М.И. Методическое пособие к практическим занятиям по очистке белков. Владивосток: Изд-во Дальневост. ун-та, 2006.
Вопросы для самоконтроля.
По каким параметрам различаются индивидуальные белки?
Для каких целей необходимо получение индивидуальных белков?
Почему большинство методов органической химии, применяемых для выделения того или иного вещества из смеси, обычно не подходит для выделения белков?
Перечислите стадии поучения индивидуального белка в гомогенном виде.
Назовите методы гомогенизации биологических материалов при выделении белка.
Какие растворы используются при экстракции белков из гомогенатов?
Каким образом нерастворимые фракции отделяют от экстрактов белков?
Каковы основные принципы разделения белков?
Перечислите методы фракционирования белков.
Перечислите диапазон применимости каждого.
Назовите преимущества и недостатки имеющихся методов.
В чем состоит метод высаливания белков?
Опишите принцип метода изоэлектрического фокусирования.
Каким образом белковые растворы очищают от низкомолекулярных примесей?
Назовите принципы определения гомогенности белка.
Назовите методы определения молекулярной массы белка.
Как определить молекулярную массу выделенного в чистом виде белка?
В чем состоит преимущество определения молекулярной массы белка методом гель-проникающей хроматографии?
ТЕМА 4.
Общие принципы хроматографии, классификация методов хроматографии.
Указания к изучению темы.
Общие принципы хроматографии, разработанные в 1903 г. отечественным ученым М. С. Цветом, основаны на способности некоторых химических соединений специфически связываться с адсорбентом, заключенном в колонке. В результате происходит разделение анализируемых веществ и их концентрирование в строго определенном слое адсорбента. Затем через колонку пропускают подходящие растворители, которые ослабляют силы адсорбции и выносят с током раствора индивидуальные вещества. Последние последовательно собирают по фракциям.
Колоночная хроматография с различными ионообменными смолами, производными целллюлозы и гидроксилапатитом в качестве носителей оказалась очень эффективным средством разделения белков из их смеси. При выделении и очистке белков используют четыре основных типа хроматографии: адсорбционную, распределительную, ионообменную и аффинную. В основе каждого из них лежат. Колоночная хроматография широко применяется не только для разделения белков, но и для разделения многих других веществ, входящих в состав живых организмов.
Адсорбционная хроматография. Разделение компонентов смеси основано на их различной сорбируемости на твердом адсорбенте. В качестве сорбентов используют активированный древесный уголь, гель фосфата кальция, оксиды кремния или алюминия. Адсорбент в виде суспензии с растворителем вносят в стеклянную вертикальную колонку и равномерно в ней упаковывают. Образец в небольшом объеме растворителя наносят на колонку – составляющие части разделяемой смеси сорбируются на адсорбенте. Затем приступают к стадии десорбции компонентов из колонки, применяя подходящие элюенты. Сбор фракций осуществляют при помощи коллектора фракций.
Распределительная хроматография. В этом случае твердая фаза служит только вместилищем для стационарной жидкой фазы. Часто распределительная хроматографии осуществляется на колонках, в которых в качестве стационарной фазы применяют влажный крахмал или силикагель. Образец растворяют в подходящем растворителе, затем наносят на колонку; разделяемые компоненты, подвергающиеся многократному распределению между неподвижной стационарной фазой и движущейся фазой растворителя, с разной скоростью перемещаются ко дну колонки.Собранные при помощи коллектора фракции пробы, содержащие одно и то же вещество, соединяют для его выделения в чистом виде. Разновидностью распределительной хроматографии является хроматография на бумаге, широко используемая в биохимических лабораториях для разделения пептидов, аминокислот и других веществ. В качестве стационарной фазы при этом служит вода, адсорбированная целлюлозными цепями бумаги.
Ионообменная хроматография. Ионообменные смолы являются полимерными органическими соединениями, содержащими функциональные группы, способные вовлекаться в ионный обмен. Различают положительно заряженные анионообменники, представленные органическими основаниями и аминами, и отрицательно заряженные катионообменники, содержащие фенольные, сульфо- или карбоксильные группы. Из сильно- и слабоосновных анионообменников чаще используют производные полистирола и целлюлозы. Катионообменники представлены сульфонированными полистиролами (производными винилбензола или дивинилбензола) и карбоксиметилцеллюлозой. В зависимости от заряда разделяемых белков используют подходящую ионообменную смолу, с функциональными группами которой обменивается и задерживается на колонке часть белков, в то время как остальные белки беспрепятственно элюируются с колонки. Задержавшиеся на колонке белки снимают с нее, используя более концентрированные солевые растворы или изменяя рН элюента. Новейшие методы ионообменной хроматографии, в частности высокоэффективная жидкостная хроматография, широко используются в фармакологии, в клинической биохимии, в биотехнологических процессах и производствах: они позволяют определять вещества в нано- и пикограммных количествах.
Аффинная хроматография (хроматография по сродству). Основана аффинная хроматография на принципе избирательного взаимодействия белков с иммобилизованными на носителе специфическими веществами –лигандами, которыми могут быть субстраты или коферменты, антигены (или антитела), гормоны или рецепторы. Благодаря высокой специфичности белков к иммобилизованному лиганду, связанному с наполнителем хроматографической колонки, присоединяется только один какой-либо белок из смеси белков. Снятие с колонки этого белка осуществляют элюированием буферными смесями с измененными рН или ионной силой, а также введением в состав элюента детергентов, ослабляющих связи между белками и лигандами. Несомненным достоинством метода является возможность в один прием выделить заданный белок или другой полимер с необходимой степенью чистоты.
Литература к теме 4:
Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. 3-е изд., Москва : Медицина, 2007.
Николаев, А. Я. Биологическая химия : учеб. / А. Я. Николаев. – 3-е изд., перераб. и доп. – М., 2007.
Сова В.В.,Кусайкин М.И. Методическое пособие к практическим занятиям по очистке белков. Владивосток: Изд-во Дальневост. ун-та, 2006.
Биохимия: Учеб. для вузов / Под ред. Е.С. Северина, Москва : ГЭОТАР-МЕД, 2003.
Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: МЦНМО, 2002.
Elliott. – Oxford : University Press, 2002.
Аффинная хроматография: Методы. Под ред. П.Дин, У.Джонсона, Ф.Мидл. М.: Мир, 1988.
Вопросы для самоконтроля.
В чем состоят основные принципы хроматографии?
Перечислите основные виды адсорбентов, используемых в хроматографии.
Назовите основные типы хроматографии, используемые при выделении и очистке белков.
Какие физические и химические механизмы лежат в основе абсорбционной хроматографии?
Какие физические и химические механизмы лежат в основе распределительной хроматографии.
Какие физические и химические механизмы лежат в основе ионообменной хроматографии?
Какие физические и химические механизмы лежат в основе афинной хроматографии.
Опишите сферы применения разных видов хроматографии.
Перечислите современные достижения в науке и технологиях, достигнутые с применением хроматографических методов.
|
