Пробы для выделения вируса
Пробы фекалий. От каждого больного берут две пробы фекалий. Первую пробу необходимо взять сразу после того, как предварительный диагноз ПМ (подозрение на ПМ) или ОВП будет установлен. Вторую пробу фекалий берут с интервалом в 24 - 48 часов. В летальных случаях секционные пробы необходимо взять в первые часы после смерти.
Оптимальный объем пробы фекалий - 4-8 г (соответствует величине ногтя большого пальца). Пробу помещают в стерильную (прокипяченную) сухую пробирку или пенициллиновый флакон с резиновой пробкой. В отдельных случаях, когда фекалии получить затруднительно, допускается взятие пробы из прямой кишки. Для этого стерильный ватный тампон вводят в прямую кишку и протирают слизистую оболочку так, чтобы захватить больше фекального материала. Тампон, отломив палочку, помещают в стерильную пробирку или флакон с резиновой пробкой. До отправки в лабораторию пробы хранят при 0 - +8 °C.
Секционные пробы. В летальных случаях для вирусологического исследования, возможно раньше после наступления смерти, берут кусочки ткани (примерно 1 куб. см) из шейного и поясничного отделов спинного мозга, продолговатого мозга и Варолиева моста, а также из нисходящей толстой кишки. Ткани иссекают стерильным инструментом и помещают в отдельные стерильные пробирки или флаконы. Из толстой кишки иссекают сегмент длиной 3-5 см, содержащий фекальные массы. До отправки в лабораторию пробы хранят при 0 - +8 °С. Двумя основными методами лабораторного подтверждения энтеровирусной инфекции являются выделение вируса и обнаружение РНК энтеровирусов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР используют при исследовании спинномозговой жидкости и материалов из верхних дыхательных путей.
Пробы крови для серологических исследований
Для диагностического исследования необходимы 2 пробы крови. Первая проба должна быть взята в день поступления больного и постановки предварительного диагноза, вторую пробу берут 2-3 недели спустя. Кровь берут стерильным шприцем из вены (5 мл) и помещают в стерильную пробирку со стерильной ватной пробкой. В отдельных случаях допустимо взять кровь уколом пальца, собирая ее стерильной пипеткой в маленькую стерильную пробирку с резиновой пробкой (0,3-0,4 мл). Пробы крови (без добавления антикоагулянтов или консервантов) оставляют для свертывания при комнатной температуре (2 часа). После этого сгусток отделяют от стекла стерильной пастеровской пипеткой ("обводят") или отбивают от стекла двумя пальцами. Затем пробирку с кровью помещают в холодильник (на ночь), а затем стерильно отделяют сыворотку от сгустка. Сыворотку освобождают от остатка эритроцитов низкоскоростным центрифугированием (10 мин. при 500-1000 об./мин.) или отстаиванием и переносят в стерильную пробирку стерильной пипеткой. Соблюдение стерильности при взятии пробы крови и последующей ее обработке является необходимым условием, так как серологические исследования при полиомиелите проводятся в культуре ткани и загрязнение сыворотки посторонней микрофлорой может исказить результаты.
До отправки в лабораторию пробы сыворотки хранят при 0 - +8 °С.
Этикетировка проб
Вирусологические и серологические пробы снабжаются этикеткой (обычно для этой цели используют лейкопластырь), на которой четко обозначают фамилию больного, тип пробы и дату взятия. Одновременно с пробами в лабораторию направляются следующие сведения о каждой пробе от каждого больного: фамилия, имя, отчество, адрес, возраст, пол, данные о предшествующих вакцинациях против ПМ (тип вакцины, даты прививок), клинический диагноз, дата начала болезни, тип пробы, дата взятия. Обязательно сообщается фамилия, имя, отчество и адрес врача (медицинского работника), направляющего пробы и запрашивающего результаты исследований.
Хранение и пересылка проб
При хранении и транспортировании проб количество вируса и антител могут уменьшаться, что могут значительно повлиять на результаты лабораторных исследований. Поэтому при хранении и пересылке пробы, прежде всего защищают от нагревания и высыхания. Пробы необходимо хранить и транспортировать при 0 - +8 °С.
Пересылку проб осуществляют в термоизолирующих контейнерах (коробках, сумках) с охлаждающими пакетами. Пробы помещают в пластиковый мешок или коробку с достаточным количеством адсорбирующего материала на случай непредвиденной утечки жидкости. Сопровождающие документы помещают в водонепроницаемый пакет и вкладывают в контейнер.
Выделенные в лаборатории штаммы типируют как I, II и III типы вируса полиомиелита и определяют их принадлежность к "диким" или вакцинно-родственным вариантом. При оценке результатов серологического обследования сывороток следует учитывать, что диагностическое значение имеет не менее чем 4-кратное нарастание титра специфических антител. При отрицательных результатах вирусологического исследования значение серологических данных приобретает особое значение. В случае получения 1-ой пробы сыворотки в поздние сроки можно не выявить четкого нарастания титра антител. В этих случаях косвенное диагностическое значение приобретают высокие титры (1:64 и выше), особенно если это монореакция, т.е. высокие титры к какому-то одному типу вируса полиомиелита.
6. Правила забора и транспортирования материалов от больных энтеровирусными заболеваниями для проведения серологических исследований
Для подтверждения диагноза проводят забор соответствующих материалов: тканей, фекалий, носоглоточных смывов, крови, везикулярной жидкости, спинномозговой жидкости и транспортирование их в лабораторию. Для успешного лабораторного исследования необходимо проводить как можно более ранний забор проб. Для забора проб используют стерильную стеклянную или пластиковую посуду.
Две пробы фекалий и для выделения вируса отбирают в течение 7 дней после начала болезни, но не позднее 14 дней, с интервалом 24-48 часов.
Носоглоточные/глоточные смывы отбирают в первые 3-4 дня от начала заболевания. Для получения смывов можно использовать стерильную дистиллированную воду, бульон или солевой раствор. Отбор материала с помощью глоточного тампона производят в те же сроки. Тампоном протирают заднюю стенку глотки, миндалин и небных дужек. Тампоны помещают в пробирку с 1-2 мл раствора Хэнкса; пробу исследуют сразу или хранят в замороженном виде.
Спинномозговую жидкость берут в первые дни болезни в асептических условиях стерильным шприцем только по клиническим показаниям.
Пробы крови для серологической диагностики следует брать утром натощак. На всех этапах взятия и обработки крови принимают меры для предотвращения гемолиза. Первую пробу крови (5 мл) берут как можно раньше после начала болезни, вторую - на 3-4 неделе, в стадии реконвалесценции. Параллельно кровь исследуют на выделение вируса - возбудителя болезни.
В случае летального исхода для исследования забирают секционные материалы - ткани головного, спинного и продолговатого мозга и Варолиева моста, содержимое кишечника и ткань кишечной стенки.
Собранные пробы немедленно отправляют в лабораторию. Все пробы, кроме фекалий, спинномозговой жидкости и крови, сразу же после взятия помещают в транспортировочную среду. Если отправка проб задерживается, их помещают в холодильник при температуре +4 - +8 °С. Если время отправки превышает 24 часа, пробы замораживают при температуре -20 °С или ниже. Повторное замораживание и оттаивание сывороток (больше 4 раз) может оказать неблагоприятное влияние на титр антител. Пробы помещают в пластиковые мешки, так, чтобы избежать протечек и повреждений.
Материал для исследований направляют в вирусологическое отделение микробиологической лаборатории Управления Роспотребнадзора по Свердловской области по адресу: г. Екатеринбург, пер. Отдельный, д. 3.
7. Способы взятия, условия хранения и транспортирования клинического материала для лабораторной диагностики вируса гриппа птиц (МУК 4.2.2136-06)
Мазки из ротоглотки
Сбор материала
|
Мазки берут сухими стерильными зондами с ватными тампонами вращательными движениями с поверхности миндалин, небных дужек и задней стенки ротоглотки после предварительного полоскания полости рта водой.
После взятия материала тампон помещают в стерильную одноразовую пробирку с 50 мкл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида или раствор фосфатного буфера. Конец зонда отламывают или отрезают, чтобы плотно закрыть пробирку.
|
Предобработка проб
|
Не требуется.
|
Метод исследования
|
ОТ-ПЦР.
|
Условия хранения материала
|
При температуре от 2 до 8 °С в течение 3 суток.
При температуре минус 70 °С или в жидком азоте - длительно.
Допускается только однократное замораживание - оттаивание материала.
Температура хранения минус 20 °С не допускается.
|
Условия транспортирования материала
|
В специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:
- при температуре 0-4 °С не более трех суток;
- при температуре минус 70 °С или в жидком азоте - длительно. Температура транспортировки минус 20 °С допускается только с учетом однократного замораживания и транспортировки без размораживания не более 4 дней.
|
Мазки из носа
Сбор материала
|
Мазки (слизь) берут сухими стерильными зондами с ватными тампонами. Зонд с ватным тампоном вводят легким движением по наружной стенке носа на глубину 2-3 см до нижней раковины. Затем зонд слегка опускают книзу, вводят в нижний носовой ход под нижнюю носовую раковину, делают вращательное движение и удаляют вдоль наружной стенки носа.
Для метода иммунофлюоресценции забор материала производят перед другими манипуляциями. После взятия материала тампон помещают в пробирку с 2-3 мл фосфатно-солевого буферного раствора. Для получения суспензии клеток тампоны в пробирке тщательно отжимают о стенки пробирки. Тампон удаляют. Пробирку закрывают.
Для ПЦР-анализа - после взятия материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную одноразовую микропробирку с 500 мкл стерильного 0,9% раствора натрия хлорида. Конец зонда отламывают, чтобы можно было плотно закрыть крышку пробирки.
|
Предобработка проб
|
Для метода иммунофлюоресценции клетки осаждают центрифугированием в течение 5-6 мин. при 3000 об./мин. Надосадочную жидкость удаляют, а клеточный осадок ресуспендируют в нескольких каплях и наносят на предметные стекла (не менее 3 шт.) раздельными каплями. Препарат высушивают и фиксируют 10 мин. в охлажденном до 2-8 °С химически чистом ацетоне.
Для ПЦР-анализа не требуется.
|
Метод исследования
|
МФА, ОТ-ПЦР.
|
Условия хранения материала
|
Для метода иммунофлюоресценции фиксированные неокрашенные мазки можно хранить при температуре от 2 до 8 °С в течение 6-7 дней, при температуре минус 20 °С - до 6 мес.
|
Условия транспортирования
|
Для метода иммунофлюоресценции в термоконтейнере с охлаждающими элементами при температуре от 0 до 4 °С. Для ПЦР:
В специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:
- при температуре 0-4 °С не более трех суток;
- при температуре минус 70 °С или в жидком азоте - длительно. Температура транспортировки минус 20 °С допускается только с учетом однократного замораживания и транспортировки без размораживания не более 4 дней.
|
Смывы из полости носа
Сбор материала
|
Сбор материала производят в положении больного сидя с отклоненной назад головой. Для получения смыва из полости носа в оба носовых хода поочередно с помощью одноразового шприца вводят по 3-5 мл теплого стерильного 0,9% раствора натрия хлорида. Промывную жидкость из обоих носовых ходов собирают через воронку в одну стерильную пробирку. Не допускается повторное использование воронки без предварительного обеззараживания автоклавированием.
|
Предобработка проб.
|
Не требуется.
|
Метод исследования
|
ОТ-ПЦР.
|
Условия хранения материала
|
При температуре от 2 до 8 °С в течение 3 суток.
При температуре минус 70 °С или в жидком азоте - длительно.
Допускается только однократное замораживание - оттаивание материала.
Температура хранения минус 20 °С не допускается.
|
Условия транспортирования материала.
|
В специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:
- при температуре 0-4 °С не более трех суток;
- при температуре минус 70 °С или в жидком азоте - длительно. Температура транспортировки минус 20 °С допускается только с учетом однократного замораживания и транспортировки без размораживания не более 4 дней.
|
Смывы из ротоглотки
Сбор материала
|
Перед сбором материала необходимо предварительное полоскание полости рта водой. После этого проводят тщательное полоскание ротоглотки (в течение 10-16 сек.) 8-10 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Жидкость собирают через воронку в стерильную пробирку. Не допускается повторное использование воронки без предварительного обеззараживания автоклавированием.
|
Предобработка проб
|
Не требуется.
|
Метод исследования
|
ОТ-ПЦР.
|
Условия хранения материала
|
При температуре от 2 до 8 °С в течение 3 суток.
При температуре минус 70 °С или в жидком азоте - длительно.
Допускается только однократное замораживание - оттаивание материала.
Температура хранения минус 20 °С не допускается.
|
Условия транспортирования материала
|
В специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:
- при температуре 0-4 °С не более трех суток;
- при температуре минус 70 °С или в жидком азоте - длительно. Температура транспортировки минус 20 °С допускается только с учетом однократного замораживания и транспортировки без размораживания не более 4 дней.
|
Носоглоточное отделяемое
Сбор материала
|
Производится натощак после взятия мазков из полости носа.
Осуществляется двумя способами:
1. Больной в три приема прополаскивает горло 10-15 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Смыв собирают в одноразовые полипропиленовые флаконы с завинчивающимися крышками объемом 50 мл. Ватными тампонами, зажатыми пинцетом, протирают заднюю стенку глотки и носовые ходы. Ватные тампоны опускают во флакон со смывом.
2. Сухим или слегка увлажненным 0,9% раствором натрия хлорида тампоном, который удерживают с помощью пинцета, протирают заднюю стенку глотки и опускают его в пробирку с 5 мл стабилизирующей среды. Процедуру повторяют 2 раза. Все тампоны от одного больного собирают в одну пробирку. После взятия материала тщательно протирают носовые ходы небольшими ватными тампонами и опускают их в ту же пробирку. Пробирку закрывают.
|
Предобработка проб
|
Тампоны прополаскивают в стабилизирующей среде, в которой они содержались, отжимают о стенку сосуда и удаляют. Смыв отстаивают в холодильнике 40-60 мин. Центрифугирование и фильтрацию не проводят. Для выделения вируса используют среднюю часть отстоя, которую небольшими порциями переносят в 3 стерильные пробирки. Одну используют для выделения вируса. Остальные замораживают при температуре минус 70 °С или в жидком азоте.
|
Метод исследования
|
Выделение вируса
|
Условия хранения
|
При температуре от 2 до 8 °С - не более 3-х дней. При температуре минус 70 °С или в жидком азоте - длительно. Допускается только однократное замораживание - оттаивание материала. Температура хранения минус 20 °С не допускается.
|
Условия транспортирования
|
В специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:
- при температуре 0-4 °С не более трех суток;
- при температуре минус 70 °С или в жидком азоте - длительно. Температура транспортировки минус 20 °С допускается только с учетом однократного замораживания и транспортировки без размораживания не более 4 дней.
|
Фекалии
Сбор материала
|
Используют пробы фекалий массой 1-3 г (1-3 мл). Исследования мазков неинформативно из-за низкого содержания в них возбудителей. Фекалии забирают из предварительно продезинфицированного горшка или подкладного судна. Пробу в количестве 1 г отдельным наконечником с аэрозольным барьером или одноразовыми лопатками переносят в специальный стерильный флакон.
|
Предобработка проб
|
При исследовании нативных фекалий без предшествующего замораживания готовят фекальную суспензию (при водянистой консистенции фекалий в виде прозрачной жидкости фекальную суспензию не готовят). Приготовление фекальной суспензии:
В соответствующее пробам количество микроцентрифужных пробирок (объемом 1,5 мл) вносят 0,8 мл фосфатного буфера (стерильного изотонического раствора натрия хлорида. В каждую пробирку отдельным наконечником с аэрозольным барьером (или одноразовыми лопатками вносят 0,1 г (0,1 мл) фекалии и тщательно ресуспендируют на вортексе до образования гомогенной суспензии.
При невозможности исследования материала в течение суток и/или необходимости длительного хранения к 10-20% суспензии фекалий в фосфатном буфере (или стерильном изотоническом растворе натрия хлорида) добавляют глицерин в конечной концентрации 10-15%. Подготовленные таким образом пробы замораживают только после тщательной гомогенизации и экспозиции с глицерином в течение 30-40 мин.
Приготовление осветленного экстракта фекалий: Для приготовления осветленного экстракта фекалий используют фекалии водянистой консистенции, свежеприготовленную суспензию фекалий или суспензию, подвергавшуюся замораживанию с глицерином.
Взвесь фекалий интенсивно гомогенизируют на вортексе.
|
Метод исследования
|
ОТ-ПЦР
|
Условия хранения материала
|
При температуре от 2 до 8 °С - не более 3-х дней. При температуре минус 70 °С или в жидком азоте - длительно. Допускается только однократное замораживание - оттаивание материала. Температура хранения минус 20 °С не допускается.
|
Условия транспортирования
|
В специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:
- при температуре 0-4 °С не более трех суток;
- при температуре минус 70 °С или в жидком азоте - длительно. Температура транспортировки минус 20 °С допускается только с учетом однократного замораживания и транспортировки без размораживания не более 4 дней.
|
Секционный материал
Сбор материала
|
В качестве секционного материала используются ткани легких, трахеи, сегментарных бронхов, селезенки. Секционный материал собирают в одноразовые полипропиленовые флаконы с завинчивающимися крышками объемом 50 мл.
|
Предобработка проб
|
Кусочки органов гомогенизируют в стерильных фарфоровых ступках и готовят 10% суспензию на стерильном 0,9% растворе натрия хлорида или фосфатном буфере. Суспензию переносят в микропробирку на 1,5 мл и центрифугируют при 10000 оборотах в течение 30 сек. Супернатант используют для выделения РНК.
|
Метод исследования
|
ОТ-ПЦР
|
Условия хранения материала
|
При температуре от 2 до 8 °С - не более 3-х дней. При температуре минус 70 °С или в жидком азоте - длительно. Допускается только однократное замораживание - оттаивание материала. Температура хранения минус 20 °С не допускается.
|
Условия транспортирования
|
В специальном термоконтейнере с охлаждающими элементами или в термосе со льдом:
- при температуре 0-4 °С не более трех суток;
- при температуре минус 70 °С или в жидком азоте - длительно. Температура транспортировки минус 20 °С допускается только с учетом однократного замораживания и транспортировки без размораживания не более 4 дней.
|
Приложение
к письму Министерства здравоохранения
Свердловской области
от 08.06.2015г. №03-01-82/5925
|
