|
Скачать 0.9 Mb.
|
|
Министерство образования и науки Российской Федерации Сибирский федеральный университет ЭНЗИМОЛОГИЯ Учебно-методическое пособие к лабораторным занятиям Специальность 020208.65 – Биохимия Красноярск СФУ 2012 УДК 577.17(07) ББК 28.072.534Я73 Составители: Н.М.Титова, Т.Н.Субботина Энзимология : Лабораторный практикум /[Текст] / сост. Н.М. Титова, Т.Н. Субботина. – Красноярск: Сиб. федер. ун-т, 2012. – 60 с. Методические указания к лабораторному практикуму по курсу «Энзимология» составлены в соответствии с программой курса и являются основным учебно-методическим руководством по проведению его лабораторного практикума. В учебном пособии представлены подробные, четко структурированные работы по основным разделам курса «Энзимология» разной степени сложности. Предназначено для студентов биологических и медико-биологических специальностей университетов. УДК 577.17(07) ББК 28.072.534Я73 © Сибирский федеральный университет, 2012 РАБОЧАЯ ПРОГРАММА КУРСА «ЭНЗИМОЛОГИЯ» Раздел 1. Структура и свойства ферментов Катализ и катализаторы. Ферменты как особые представители катализаторов. Краткие исторические сведения о развитии энзимологии. Применение ферментов в промышленности, сельском хозяйстве, медицине. Новые пути практического использования ферментов. Иммобилизованные ферменты. Инженерная энзимология. Принцип классификации ферментов. Классы ферментов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы. Характеристика классов и важнейших групп ферментов. Основные положения систематической и тривиальной номенклатуры ферментов. Методы регистрации ферментативной активности. Способы количественного выражения активности ферментов. Единицы ферментов. Международная единица. Катал. Удельная активность, молекулярная активность, активность каталитического центра. Определение активности ферментов. Характеристика стационарных (по конечной точке) и кинетических методов определения активности ферментов. Прямой и непрямой оптический тест Варбурга. Расчёт ферментативной активности при определении активности по конечной точке и при кинетическом определении. Сопряженные реакции (с одним, двумя и более сопрягающими ферментами). Основные требования к сопряженным ферментативным реакциям. Методы определения активности ферментов: колориметрический, спектрофотометрический, флуориметрический, манометрический, биолюминесцентный, иммунохимический и др. Уровни структурной организации ферментов. Принципы пространственной организации молекул ферментов, проблема сворачивания полипептидной цепи в нативную конформацию. Шапероны «белки теплового шока» – hsp (heat shock proteins) – специальные «машины» для фолдинга белков, осуществляющие этот процесс наиболее эффективно в условиях краудинга (crowding – толкучка, молекулярная теснота новосинтезированных полипептидных цепей) в живой клетке. Структура и роль шаперонов. Шаперонины. Посттрансляционные модификации. Роль доменов в пространственной организации молекул ферментов. Классификация доменов. Домены, обеспечивающие формирование активного центра. Домены, участвующие в регуляции ферментативной активности. Домены, обеспечивающие связывание ферментов с мембранами. Роль доменов в осуществлении аллостерической регуляции. Бифункциональные ферменты: катализирующие реакции одного метаболического пути (аспартокиназа – гомосериндегидрогеназа); катализирующие противоположно направленные реакции (6-фосфофрукто-2-киназа-фруктозо-2,6-бисфосфатаза). Кофакторы ферментов и их роль в катализе. Классификация кофакторов. Коферменты, простетические группы, ионы металлов. Коферменты окислительно-восстановительных реакций – NAD, NADP, FMN, FAD, железопорфирины, убихиноны, аскорбиновая кислота. Физико-химические свойства, взаимодействие с апобелками, биохимические функции. NAD(Р)-зивисимые дегидрогеназы (лактатдегидрогеназа, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа). Флавиновые ферменты (сукцинатдегидрогеназа, липоамиддегидрогеназа). Каталаза, глутатионпероксидазы. Цитохромы класса a, b, c, d и др. Роль аскорбиновой кислоты в функционировании тирозиназы. Коферменты – переносчики групп: нуклеозидфосфаты, фосфаты сахаров, HSCoA, пиридоксальфосфат, тетрагидрофолиевая кислота. Коферменты синтеза, изомеризации и расщепления связей: тиаминдифосфат, биотин, кобамидные коферменты. АТР-зависимые ферменты (гексокиназа, тиамин-пирофосфотрансфераза, нуклеотидилтрансферазы). Пиридоксальфосфат-зависимые ферменты (аминотрансферазы, декарбоксилазы). Ферменты, использующие тетрагидрофолиевую кислоту для переноса одноуглеродных фрагментов (метил-, формил-, гидроксиметил-, метиле-, метенил- и формиминотрансферазы). Роль металлов в функционировании ферментов. Топография активных центров простых и сложных ферментов. Активный центр ферментов. Якорный (субстратсвязывающий) и каталитический сайты активных центров. Активные центры простых и сложных ферментов. Методы определения аминокислот, входящих в активные центры ферментов. Химическая модификация, действие ингибиторов, квазисубстраты, алкилирование, блокирование SH-групп. Роль серина, гистидина, лизина, тирозина, цистеина, аргинина, аспарагиновой и глутаминовой кислот в активных центрах. Глицин, цистеин и пролин как структурообразующие аминокислоты. Структура активных центров на примере лактатдегидрогеназы, химотрипсина, простагландин-Н-синтазы, карбоангидразы, триозофосфатизомеразы. Использование методов рентгеноструктурного анализа и сайт-специфического мутагенеза для изучения топографии активных центров. Ингибиторный анализ. Биоинформационный подход в изучении активных центров ферментов. Раздел 2. Ферментативный катализ. Факторы, определяющие эффективность действия ферментов. Сущность явления катализа. Гомогенный и гетерогенный катализ. Ферментсубстратный комплекс, стадии образования и распада, доказательства существования. Лимитирующие стадии ферментативных реакций. Природа сил, стабилизирующих различные конформационные состояния ферментсубстратного комплекса (водородные связи, гидрофобные взаимодействия, координационные связи, электростатические взаимодействия, силы Ван-Дер-Ваальса). Факторы, определяющие эффективность и специфичность ферментативного катализа: эффект сближения и ориентации, напряжения и индуцированного соответствия, кислотно-основного и ковалентного катализа. Кислоты и основания в ферментативном катализе. Физико-химические механизмы катализа. Карбоксипептидазы А – строение, свойства, механизм действия(2 часа) Каталитические центры гидролаз. Деление гидролаза на четыре типа по строению активного центра и механизму действия. Карбоксипептизала А (КПА) – гидролаза, использующая комплекс Zn2+ для активации воды и субстрата. Образование активной формы фермента из прокарбоксипептизазы А. Субстраты фермента. Структура активного центра КПА: субстратсвязывающие и каталитические аминокислотные остатки. Работы У. Липскомба с сотрудниками по установлению молекулярного механизма действия КПА. Глицилтирозин – «квазисубстрат» для КПА. Механизм действия лизоцима. Исследования Д. Филипса. Экспериментальные подходы для выяснения механизма действия ферментов: кинетические исследования (вариации концентрации субстрата); модификация структуры субстрата; обратимое ингибирование; вариации рН; предстационарная кинетика (образование ES-комплексов, определение скоростей отдельных стадий реакции); сайт-специфический мутагенез. Специфичность – уникальное свойство ферментов. Специфичность – особая способность фермента осуществлять выбор субстрата данной структуры из большой совокупности близких по строению веществ. Концепция стерического соответствия «ключ-замок» (Э. Фишер). Концепция индуцированного соответствия (Д. Кошланд). Абсолютная специфичность действия (уреаза). Стереоспецифичность ферментов (D- L-стереоизомеры, цис- и транс-стереоизомеры). А- и В-классы NAD(P)-зависимых дегидрогеназ. Относительная иди групповая специфичность действия. Протеазы как пример ферментов с относительной специфичностью. Специфичность сериновые протеазы (трипсин, химотрипсин, эластаза). Раздел 3. Регуляция активности и компатментализация ферментов Ферменты в клетке и в организованных системах. Локализация ферментов в клетке. Понятие компартментализации на примере лизосомальных, митохондриальных ферментов. Уровни организации ферментов. Протомеры (ферменты с третичной структурой) – гидролитические ферменты (пепсин, трипсин и др.). Олигомерные ферменты, состоящие из нескольких протомеров с одинаковыми или различными функциями; надмолекулярные комплексы: мультиферментные комплексы, мультиферментные конъюгаты; ферментные ансамбли: адсорбционные, интегральные. Мультиферментные конъюгаты – комплекс синтазы жирных кислот,. КАД (CAD)-комплекс. Мультиферментные комплексы – пируватдегидрогеназный комплекс, α-кетоглутаратдегидрогеназный комплекс. Метаболоны – мультиферментные ансамбли, фиксированные на мембранах и структурных элементах клетки. Гликолитический метаболон эритроцитов, принципы организации, регуляция внутри- и внеклеточными сигналами. Метаболон цикла лимонной кислоты. Изостерические и аллостерические механизмы регуляции активности ферментов. Регуляция активности ферментов внутриклеточными сигналами. Изо-стерическая регуляция (регуляция доступностью субстрата, кофактора). Компартментализация субстратов и ферментов. Регуляция продуктом реакции. Аллостерические механизмы регуляция. К- и V- классы аллостерических ферментов. Регуляция активности фосфофруктокиназы. Аллостерические механизмы регуляции пируватдегидрогеназного комплекса. Регуляторные энзимопатии. Генетически обусловленные регуляторные энзимопатии. Нарушение регуляции фосфофруктокиназы цитратом. Регуляция метаболических путей. Ретроингибирование – ингибирование анаболических путей их конечными продуктами. Исследования Жакоба и Моно. Типы ретроингибирования. Ковалентная модификация ферментов и ее типы. Химическая модификация ферментов – быстрый механизм регуляции активности ферментов внешними сигналами. Типы химической модификации ферментов (фосфорилирование, аденилирование и уридилирование, ацетилирование, ADP-рибозилирование). Аденилатциклаза, фосфолипаза С. Протеинкиназы, типы. Протеинкиназа А, регуляция активности сАМР. Протеинкиназа С, регуляция активности диацилглицеролом, фосфолипидами и ионами кальция. Обратимость процесса ковалентной модификации. Протеинфосфатазы. Специфические рецепторы: серпентиновые и тирозинкиназные рецепторы. Рецепторы – ионные каналы. Каскадный механизм регуляции активности гликогенфосфорилазы и гликогенсинтазы гормонами. Регуляция с помощью белок-белковых взаимодействий (присоединение или отщепление регуляторных субъединиц или белков-регуляторов). Регуляция активности аденилатциклазы, киназы гликогенфосфорилазы. Образование ферментов из неактивных предшественников (проферментов, зимогенов). изменение ковалентной структуры фермента в результате расщепления одной или нескольких пептидных связей. Активация трипсина, химотрипсина, эластазы, карбоксипептидазы А, фосфолипизы А2 и пепсина. Регуляция количества ферментов в клетке. Контроль количества ферментов в клетке – процесс, зависящий от соотношения скоростей их биосинтеза и деградации. Время полужизни различных ферментов. Биосинтез ферментов и его регуляция на генетическом уровне. Конститутивные и индуцибельные (адаптивные) ферменты. ATP-зависимые протеазы прокариот. Репрессия и индукция биосинтеза ферментов. Убиквитин-протеосомный путь деградации белков у эукариот. Убиквитин – белок, маркирующий белки для деградации. Строение 26S протеосомы. Раздел 4. Прикладное значение ферментов Инженерная энзимология. Иммобилизованные ферменты. Носители для иммобилизации: природные и синтетические. Методы иммобилизации: физические (адсорбция, включение в гель, микрокапсулы, липосомы, ферментные пленки), химические (ковалентное сшивание с носителем, сшивка би- или полифункциональными реагентами). Применение иммобилизованных ферментов в промышленности, медицине, биомониторинге окружающей среды. Ферменты в медицине. Три главных направления развития медицинской энзимологии: энзимопатология, энзимодиагностика и энзимотерапия. Энзимопатология. Врождённые (наследственные) энзимопатии. Классификация. Механизм возникновения наследственных энзимопатий. Метаболический блок обмена веществ. Приобретённые энзимопатии: пищевые и токсические. Клинические проявления энзимопатий. Энзимопатии с клиническими проявлениями. Относительно бессимптомные энзимопатии. Бессимптомные энзимопатии. Энзимодиагностика. Органная специфичность в распределении ферментов. Секреторные, индикаторные и экскреторные ферменты. Функциональные и нефункциональные ферменты. Факторы, влияющие на уровень ферментов во внеклеточной жидкости. Недостатки ферментативного анализа. Основные принципы дифференциальной диагностики при использовании ферментативных тестов. Ранняя диагностика острого инфаркта миокарда. Диагностическое значение снижения ферментативной активности. Неспецифическое физиологическое и патологическое повышение активности ферментативной активности. Стабильность ферментов при хранении. Применение ферментов в качестве аналитических реагентов. Энзиматические методы определения метаболитов в биологических жидкостях: глюкозы (глюкозооксидаза), мочевины уреаза. Характеристика ферментов, наиболее значимых в энзимодиагностике. Аминотрансферазы: аспартатаминотрансфераза (АсАт) и аланинаминотрансфераза (АлАт). Лактатдегидрогеназа. -Амилаза. Креатинкиназа. Щелочная и кислая фосфатазы. Холинэстераза. Липаза. – Глутамилтрансфераза. Использование ферментов в качестве лекарственных препаратов. Заместительная терапия (введение отсутствующего фермента). Использование ферментов в качестве агентов, специфически разрушающих продукты обмена веществ в организме больного. Использование ингибиторов ферментов в качестве лекарственных препаратов. ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ В БИОХИМИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ Работая в лаборатории, необходимо соблюдать меры предосторожности, придерживаясь следующих правил: Общие сведения • Запрещается входить в лабораторию в верхней одежде. • Работа в биохимической лаборатории допускается только в специальном халате, так как вероятна возможность загрязнения, порчи одежды при попадании на нее едких реактивов. Обращение с реактивами • Все концентрированные кислоты и щелочи должны находиться в вытяжном шкафу. • Все опыты с ядовитыми и неприятно пахнущими веществами проводить в вытяжном шкафу. • Наливать или насыпать реактивы следует только над столом. • Не следует оставлять открытыми банки с реактивами. • Пролитые или рассыпанные реактивы нужно немедленно удалить со стола, вытерев стол тряпкой и обмыв водой. • Пролитые концентрированные кислоты следует засыпать песком, затем собрать песок лопаткой. Облитое место необходимо облить раствором соды и вытереть тряпкой. • При работе с органическими растворителями (спирты, эфиры, ацетон, бензин и др.) нельзя определять вещество по запаху, так как может произойти отравление их парами. • Наполнение пипеток растворами органических растворителей, кислот, щелочей проводят только при помощи груши. • Внимательно следить за тем, чтобы реактивы (особенно кислоты и щелочи) не попадали на лицо, руки и одежду. • Не ходить по лаборатории с концентрированными кислотами, а наливать их только в определенном, отведенном для этого месте. • Не загрязнять реактивы во время работы (не путать пробки от склянок, содержащих разные реактивы; избыток взятого реактива не выливать обратно в склянку; пользуясь пипеткой, набирать каждый реактив только предназначенной для этого пипеткой, ни в коем случае не путать их). • В случае попадания на кожу концентрированной кислоты облитое место нужно промыть большим количеством воды, а затем разбавленным раствором соды. При попадании растворов щелочей на кожу пораженное место нужно обмыть сначала разбавленной кислотой, а потом водой. Обращение с нагревательными приборами • Перед тем как зажечь спиртовку – убедиться, что поблизости нет горючих жидкостей (спирт, эфир и др.). • Зажигать спиртовку можно только спичкой. • В пробирке можно нагревать только небольшое количество раствора, жидкость должна занимать не более 1/3 объема пробирки. • Пробирку при нагревании нужно направить в сторону от себя и рядом находящихся людей. • Нельзя наклоняться над спиртовкой. В начале пробирку с раствором нужно прогреть всю, а затем нагревать в нужном месте, не вынимая из пламени спиртовки. • Нельзя нагревать пробирку долго в одном месте, так как жидкость быстро закипит и выплеснется из пробирки. • Нагревать пробирку нужно ниже уровня жидкости в ней. • При нагревании жидкости держать пробирку отверстием в сторону от сея и тех, кто находится рядом, не касаться пробиркой горящего фитиля, всегда соблюдать большую осторожность при нагревании, не допускать выплескивания жидкости (время от времени отводить пробирку от пламени, не нагревать ее в вертикальном положении), не приближать лицо к сосуду, в котором нагревается жидкость. • После нагревания следует сразу затушить спиртовку, накрыв пламя колпачком. • Работа с водяной баней осуществляется только под тягой. • При неосторожной работе могут быть ожоги нагретой стеклянной посудой. При ожогах на обожженное место нужно положить ватку, смоченную раствором марганцевокислого калия. Закончив работу, привести рабочее место в порядок.
|
|
Поиск |