Энзимология
|
Скачать 0.9 Mb.
|
|
Раздел 4. Прикладное значение ферментов РАБОТА 4.1. Определение активности трансфераз в сердечной мышце и печени крысы на биохимическом анализаторе Сапфир 400 4  .1.1. Автоматический биохимическийАнализатор сапфир 400 ТЕХНИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ: ТИП: Дискретный, произвольный доступ из 24 текущих тестов. Количество программируемых каналов – неограниченно. ПРОИЗВОДИТЕЛЬНОСТЬ: 240 анализов/час не зависимо от типа реакций. ОБРАЗЕЦ: Загрузка: 55 образцов, возможна замена роторов в процессе работы. Дозирование: 3 – 30 мкл (с шагом 0,5 мкл), звуковой сигнал уровня. РЕАГЕНТ: Расположение: поворотный стол на 48 реагентов (2x24). Тип: 1-2 компонентные системы, охлаждение 10°С, автономный режим. Дозирование: 20 – 330 мкл (с шагом 0,5 мкл), звуковой сигнал уровня. СТОЛ РЕАКЦИЙ: Тип: поворотный стол на 40 долговечных кювет (срок службы – год). Мойка: автоматическая, многостадийная, две стадии осушки. Расход воды: расход дистилл. воды 3 л /час, нет необходимости в напоре воды. Объем смеси: минимальный объем 200 мкл (оптимальный 220 мкл). ПЕРЕМЕШИВАНИЕ: патентованное многократное перемешивание с помощью потока воздуха для достижения гомогенности реакционной смеси, дополнительное перемешивание непосредственно перед измерением. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА: ежедневный. Графики <�х>-R за период времени. Распечатка отчетов. ТЕХ. ПАРАМЕТРЫ: 800 х 640 х 520, 80 кг, 220-240В, 50Гц ОПИСАНИЕ: Автоматический биохимический анализатор Сапфир-400 предназначен для работы как основной прибор в больших и средних медицинских учреждениях. Он способен работать с полной нагрузкой 24 часа в сутки и делает ровно 240 анализов в час независимо от типа методик (кинетика или конечная точка). Порядок проведения анализов Random Access , т.е. произвольный по профилю из 24 или 32 текущих тестов. Биохимический анализатор работает на любых реагентах, имеет компактный эргономический дизайн и легко помещается на столе. Биохимические анализаторы Сапфир имеют высокую отказоустойчивость и обеспечивают точность результатов в условиях большого потока исследований. Биохимические анализаторы Сапфир использует специальные долговечные кюветы, которые автоматически моются в процессе измерений (расход дист воды всего 3 л/час). Один набор кювет рассчитан на год работы. Кюветы сделаны из специального просветленного твердого пластика с пониженными по сравнению со стеклом адгезионными свойствами, что особенно важно при проведении современных латексных тестов. Состояние кювет контролируется автоматически перед каждым измерением и каждая кювета может быть заменена индивидуально по указанию контролирующей системы анализатора. Для перемешивания образцов и реагентов в кюветах используется патентованное бесконтактное пневматическое перемешивание. После внесения реакционных компонентов в кювету смесь тщательно перемешивается в четыре стадии. Еще одно дополнительное перемешивание производится непосредственно перед измерением. Этим достигается высокая повторяемость и точность результатов и при этом практически полностью исключается кросс-контаминация между кюветами. Многостадийное перемешивание является уникальной чертой биохимических анализаторов Сапфир и обеспечивает тщательное перемешивание для достижения гомогенности смеси. Эта черта является основной для проведения любых современных иммуно-турбидиметрических методик. Биохимический анализатор Сапфир 400 имеет встроенный ион-селективный модуль для измерения ионов K , Na и Cl в любых биологических жидкостях. Обеспечивается стабильная работа и высокая надежность электродов при производительности 160 тестов в час. Биохимический анализатор управляется внешним компьютером Pentium IV , принтером и TFT дисплеем . Удобный интерфейс позволяет легко адаптировать новые методики – количество протоколов неограниченно. Встроенная программа контроля качества позволяет проводить ежедневный контроль качества, анализировать накопленные данных за месяц и более и распечатывать его результаты. Результаты анализов за последние шесть месяцев сохраняются в базе данных вместе с графиками реакций. Биохимические анализаторы Сапфир спроектированы для экономичного использования реагентов: - минимальный общий объем реакционной смеси 200 мкл , типичный объем – 220 мкл - стол реагентов на 24х2 или 36х2 различных реагента активно охлаждается при 10 ± 2 ° С, встроенный холодильник для хранения рабочих реагентов может быть включен на ночь автономно - три раздельные пипетки для образца и двух реагентов практически исключают кросс-контаминацию реагентов и образцов, сенсором автоматически осуществляется контроль за остатком реагентов Биохимический анализатор Сапфир имеют все необходимые черты современного биохимического анализатора: - автоматическое разведение и повторное измерение при превышении предела линейности теста - срочный анализ в течение 10 мин без остановки общего потока исследований - современный фотометр на основе дифракционной решетки – длины волн от 340 до 950 нм, долговечная спектральная лампасо сроком работы не менее 2000 часов Биохимические анализаторы Сапфир позволяют организовать непрерывную загрузку образцов: - одновременно можно загрузить 45 образцов, 5 контролей и имеется 5 позиций для экстренных образцов, два таких ротора в входят в стандартную поставку (т.е. на 110 позиций) - специальный калибровочный ротор на 45 стандартов и 5 контролей позволяет всегда использовать разные позиции для разных калибраторов, что упрощает процесс калибровки - одновременный ввод данных возможен для 10 роторов (т.е. для максимум 550 пациентов) - для образцов могут быть использованы стандартные пробирки или 1,5 мл чашки типа Hitachi ИЗМЕРЯЕМЫЕ ПАРАМЕТРЫ: Ферменты: Щелочная фосфатаза, кислая фосфатаза и простатическая фракция, амилаза, амилаза панкреатическая, трансаминазы, креатинкиназа и MB-фракция, гидроксибутерат, ангиотензин, ГГТП, холинестераза, липаза, ЛДГ, ЛДГ-1 изофермент. Метаболиты и другие аналиты: Альбумин, общий белок, мочевина, мочевая кислота, билирубин общий и прямой, холестирин общий, холестирин высокой и низкой плотности, триглицериды, глюкоза, фруктозамин, Hgb, лактат, микропротеин, гликозилированный гемоглобин ( HbA 1 c ) Металлы и ионы: Кальций, железо и железосвязывающая способность, медь, цинк, хлориды, литий, фосфор, магний, калий, бикарбонат в т.ч. ионселективный блок для измерения K , Na , Cl Иммунотурбидиметрия: IgA, IgG, IgM, IgE , C3, C4, CRP, ASLO, RF, Tf, b 2-микроглобулин, аполипопротеиды, ферритин, a 1-антитрипсин, a 2-макроглобулин, гаптоглобин, церулоплазмин, микроальбумин, a 1-глокопротеины, преальбумин Лекарственный мониторинг: Карбамазепин, дигоксин, фенобарбитал, теофилин, гентамицин, амикацин, нетилмицин, ванкомицин, тобрамицин, фенотоин, метатрексат, циклоспорин и др. Наркотические вещества: Амфетамины, метаболиты кокаина, метаквалон, барбитураты, опиаты, бенодиазипин, этиловый спирт, фенциклидин, канабиоиды, метадон 4.1.2. Определение активности трансфераз Аминотрансферазы или трансаминазы – ферменты, содержащие в качестве коферментов фосфопиридоксаль и фосфопиридоксамин, катализируют обратимый перенос аминогрупп с аминокислот на α-кетокислоты. Определение концентрации α-кетокислот, образовавшихся в процессе трансаминирования аминокислот, лежит в основе методов определения трансаминазной активности. Существует 2 группы методов определения активности трансаминаз в сыворотке крови: спектрофотометрические и колориметрические. В основе спектрофотометрических методов лежит использование оптического теста Варбурга, эти методы наиболее специфичные и точные. Колориметрические методы основаны на образовании окрашенного динитрофенилгидразона пировиноградной кислоты, освобождающейся в результате реакции переаминирования. Наибольшее значение имеет определение активности двух ферментов – аспартатаминотрансферазы (АсАТ) и аланинаминотрансферазы (АлАТ), поскольку они обладают большой каталитическлой активностью. Эти ферменты находятся в различных тканях и органах: печени, миокарде, почках, скелетной мускулатуре и др. Содержание данных ферментов в тканях неодинаково (в печени намного выше, чем в миокарде). Определение активности аминотрансфераз проводят в гомогенатах тканей из печени и сердца крысы. Для этого проводят грубую гомогенизацию, гомогенат затем центрифугируют для получения экстрактов, которые и используют для определения активности АлАт и АсАт. Определение активности АлАт Определение активности АлАт проводят с использованием набора реагентов фирмы «Витал Диагностике СПб» для определения активности АлАт в сыворотке и плазме крови оптимизированным энзиматическим кинетическим методом. Настоящий набор реагентов относится к серии «Витал-Европа», скомпонованной в соответствии с требованиями международной федерации клинической химии (IFCC-модифицированный). Принцип метода: L-аланин + α-кетоглуторат ←АлАт→ пируват + L-глутамат; Пируват + NADH + H+ ←ЛДГ→ лактат + NAD+ Скорость окисления NADH в NAD+ пропорциональна активности АлАт. Исследуемый материал: Свежая сыворотка или плазма крови без следов гемолиза. Активность фермента в сыворотке снижается после 3 дней хранения при 4°С – на 10%, при 20°С – на 17%. Состав набора: Реагент № 1. Буфер, рН 7,5 (при 37°С) конечная концентрация L-аланин 500 ммоль/л рабочего раствора Трис/HCI 100 ммоль/л рабочего раствора Реагент № 2. Лиофилизат α –кетоглутарат 15 ммоль/л рабочего раствора NADH 0,18 ммоль/л рабочего раствора ЛДГ 1200 U/л рабочего раствора Аналитические характеристики набора: Линейность до 190 U/л Воспроизводимость коэффициент вариации не более 5% Время проведения анализа не более 4 мин Температура инкубации .37°С (25°С. 30°С). Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность: Срок хранения набора – 12 месяцев при 2 – 4 °С. Дата изготовления, серия и номер набора по каталогу указаны на упаковке. Рабочий реагент: растворите содержимое 1 флакона № 2 в 50 мл буферного раствора (флакон №1). Для получения оптимальных результатов рекомендуется выдержать рабочий реагент после полного растворения лиофилизата при комнатной температуре 5-10 мин. Тщательно закрывайте флаконы непосредственно после каждого использования реагентов. Рабочий реагент стабилен: не менее 14 суток при комнатной температуре или при хранении в «рабочем режиме №1» (6 часов при 37°С, затем 18 часов при 2-4°С), 30 суток при хранении в «рабочем режиме №2» (6 часов при 20-25°С, затем 18 часов при 2-4°С) и 45 суток при 2-4°С. Перед проведением анализа нагрейте рабочий реагент до выбранной температуры. АНАЛИЗ Фотометрирование: Hg 334 или 365 нм, спектрофотометр – 340 им, против воздуха. Кювета – 1см. Соотношение рабочий реагент/сыворотка – 10:1 (например, 0,5 мл рабочего реагента + 0,05 мл сыворотки). Введите анализируемый материал в рабочий реагент, перемешайте и через 1 минуту начинайте считывать изменения экстинкции с интервалом 1 минута (или через другие равные промежутки времени) в течение 3 минут. Вычислите среднее изменение экстинкции за 1 минуту (Е/мин). Если Е/мин превышает 0,06/мин при фотометрировании в варианте Hg 365 или 0,11/мин в варианте 340/Hg334 разведите образец в 10 раз физиологическим раствором, повторите анализ и умножьте результат на 10. Расчет активности (А): А=3235 х Е365нм/мин *[U/л] А=1746 хЕ340нм /мин *[U/л] А=1780 хЕ334нм /мин *[U/л] *1 [U/л]=16,67 нмоль/(с*л) Температурные коэффициенты пересчета:
Определение активности АсАт Определение активности АсАт проводят с использованием набора реагентов фирмы «Витал Диагностике СПб» для определения активности АсАт в сыворотке и плазме крови оптимизированным энзиматическим кинетическим методом. Настоящий набор реагентов относится к серии «Витал-Европа», скомпонованной в соответствии с требованиями международной федерации клинической химии (IFCC-модифицированный). Принцип метода: L-аспартат + α-кетоглуторат ←АсАт→ оксолоацетат + L-глутамат. оксалоацетат + NADH + H+ ←МДГ→ L-малат + NAD+ Скорость окисления NADH в NAD+ пропорциональна активности АсАт. Исследуемый материал: Свежая сыворотка или плазма крови без следов гемолиза. Активность фермента в сыворотке снижается после 3 дней хранения при 4°С – на 10%, при 20°С > на 17%. Состав набора: Реагент № 1. Буфер рН 7,8 (при 37°С) конечная концентрация L-аспартат 240ммоль/л рабочего раствора Трис/NaOH 80 ммоль/л рабочего раствора Реагент № 2. Лиофилизат α-кетоглутарат 12 ммоль/л рабочего раствора NADH 0,18 ммоль/л рабочего раствора ЛДГ 600 U/л рабочего раствора МДГ 600 U/л рабочего раствора Аналитические характеристики набора: Линейность до 190 U/л Воспроизводимость коэффициент вариации не более 5% Температура инкубации 37°С ( 25°С, 30°С) Время проведения анализа не более 4 мин. Подготовка реагентов к процедуре анализа и их стабильность: Срок хранения набора - 12 месяцев при 2 - 4 °С. Дата изготовления, серия и каталожный номер набора указаны на упаковке. Рабочий реагент: растворите содержимое 1 флакона № 2 в 50 мл буферного раствора (из флакона №1). Для получения оптимальных результатов рекомендуется выдержать рабочий реагент после полного растворения лиофилизата при комнатной температуре 5-10 мин. Тщательно закрывайте флаконы непосредственно после каждого использования реагентов. Рабочий реагент стабилен: не менее 7 суток при комнатной температуре, не менее 10 суток при хранении в «рабочем режиме №1» (6 часов при 37°С, затем 18 часов при 2-4°С), 20 суток при хранении в «рабочем режиме №2» (6 часов при 20-25°С, затем 18 часов при 2-4°С) и 45 суток при 2-4°С. Перед началом работы нагрейте рабочий реагент до выбранной температуры анализа. АНАЛИЗ Фотометрирование: Hg 334 или 365 нм, спектрофотометр - 340 нм, против воздуха. Кювета-1 см. Соотношение рабочий реагент/сыворотка – 10:1 (напр. 0,5 мл рабочего реагента + 0,05 мл сыворотки). Введите анализируемый материал в рабочий реагент, перемешайте и через 1 минуту считывайте изменения экстинкции с интервалом 1 минута (или через другие равные промежутки времени) в течение 3 минут. Вычислите среднее изменение экстинкции за 1 минуту (Е/мин). Если Е/мин превышает 0,06/мин при фотометрировании в варианте Hg 365 или 0,11/мин в варианте 340/Hg334 разведите образец в 10 раз физиологическим раствором, повторите анализ и умножьте результат на 10. Расчет активности (А): А=3235 х Е365нм/мин *[U/л] А=1746 хЕ340нм /мин *[U/л] А=1780 хЕ334нм /мин *[U/л] *1 [U/л]=16,67 нмоль/(с*л) Температурные коэффициенты пересчета:
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||