Молекулярные механизмы апоптоза при окислительном стрессе

Скачать 0.59 Mb.

Название	Молекулярные механизмы апоптоза при окислительном стрессе
страница	1/4
Тип	Автореферат

rykovodstvo.ru > Руководство эксплуатация > Автореферат

1 2 3 4

На правах рукописи

Часовских Наталия Юрьевна
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ АПОПТОЗА

ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ

14.00.16 – патологическая физиология

03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Томск – 2009

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные консультанты:
доктор медицинских наук, профессор	Рязанцева Наталья Владимировна
доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, заслуженный деятель науки РФ	Новицкий Вячеслав Викторович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН	Лишманов Юрий Борисович
доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН, заслуженный деятель науки РФ	Шкурупий Вячеслав Алексеевич
доктор медицинских наук	Масная Наталья Владимировна

Ведущая организация: ГУ НИИ физиологии СО РАМН
Защита состоится «_____» _________ 2009 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН (634028, Томск, пр. Ленина, 3)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН
Автореферат разослан «_____» ___________ 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук Амосова Е.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

На современном этапе развития зарубежной и отечественной медико-биологической науки накоплен большой объем знаний о механизмах повреждения и адаптации клеточных систем при патологических процессах разного генеза. В центре внимания исследователей находятся ключевые механизмы регуляции апоптоза, который представляет собой активную форму клеточной гибели и является физиологическим механизмом устранения избыточных и/или функционально аномальных клеток. Известно, что развитие различных болезней (злокачественные новообразования, сердечно-сосудистые, нейродегенеративные, острые и хронические воспалительные процессы, сахарный диабет и др.) связано с нарушениями механизмов реализации апоптоза, приводящими к его излишнему активированию или ингибированию [Bredesen D.E., 2000; Меньщикова Е.Б. и соавт., 2006]. Наряду с этим важным звеном патогенеза данных заболеваний является дисбаланс окислительного метаболизма [Зенков Н.К. и соавт., 2001].

Развитие окислительного стресса при ряде патологий обусловлено резкой интенсификацией процессов свободно-радикального окисления и/или снижением резерва антиоксидантной защиты, что приводит к значительному накоплению активных форм кислорода (АФК) [Скулачев В.П., 1996]. Последние вызывают окислительную модификацию белковых и липидных молекул, повреждение ДНК, нарушение структуры мембран и др. [Дубинина Е.Е., 2001; Zhu H. et al., 2001; Mathers J. et al., 2004]. Вместе с тем известно, что АФК являются внутриклеточными мессенджерами, участвующими в регуляции различных клеточных процессов, в частности - апоптоза [Safa O., 2001; Sorescu D., 2001; Октябрьский О.Н., Смирнова Г.В., 2007].

Влияние АФК на про- и антиапоптотические мишени и механизмы осуществляется непосредственно или через внутриклеточные редокс-зависимые сигнал-передающие системы [Меньщикова Е.Б. и соавт., 2006]. При этом в клетке может происходить одновременная активация нескольких молекулярных путей, взаимодействующих между собой [Wajant H., 2002; Schultz D.R., Harrington W.G., 2003].

Индуцирующие апоптоз сигналы стимулируют множество киназ, включая митоген-активируемые протеинкиназы JNK и р38. Последние воздействуют на белки-мишени, связанные с функционированием факторов транскрипции и регуляцией программированной клеточной гибели: р53, NF-κB, АР-1 и др. [Gallo K.A., Johnson G.L., 2002; Меньщикова Е.Б. и соавт., 2006]. Под контролем редокс-чувствительных транскрипционных факторов находится синтез белков семейства Bcl-2, являющихся ключевыми регуляторами апоптоза. В частности, р53 активирует экспрессию Bid, PUMA и Noxa [Oda E. et al., 2001; Sax J.K. et al., 2002], NF-κB управляет генами, кодирующими белки Bcl-X_L, IAP, A1, отвечающие за угнетение процесса апоптоза [Kucharczak J. et al., 2003]. Вместе с тем ряд исследований свидетельствуют о проявлениях редокс-чувствительными элементами сигнальной трансдукции как про-, так и антиапоптотической активности [Perkins N.D., 2004; Harada C., Nakamura K., 2006], зависящей от особенностей индуцирующих сигналов, комбинации возможных путей их передачи и типа клеток.

Данное обстоятельство затрудняет возможность идентификации механизмов развития заболеваний, сопровождающихся развитием окислительного стресса и сопряженных с дизрегуляцией летальной программы клеток. Необходимость разработки и внедрения селективных технологий управления апоптозом ставит перед фундаментальной наукой задачу идентификации редокс-чувствительных молекулярных мишеней и обосновывает целесообразность проведения комплексного исследования фундаментальных механизмов нарушения программированной гибели клеток в условиях окислительного стресса.

Цель исследования: установить редокс-чувствительные молекулярные механизмы апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови в условиях окислительного стресса.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи исследования:

Установить особенности реализации программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов, состояния рецепторного и митохондрий-опосредованного путей инициации апоптоза при окислительном стрессе.
Оценить характер изменений МАР-киназных элементов (JNK, р38) системы сигнальной трансдукции в мононуклеарных клетках крови с использованием селективных ингибиторов (SP600125, ML3403) in vitro при окислительном стрессе.
Оценить роль транскрипционных факторов NF-κB и р53 в механизмах регуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов при дисбалансе окислительного метаболизма.
Выявить особенности экспрессии мРНК и оценить содержание белков семейства Bcl-2 с про- и антиапоптотической активностью при окислительном стрессе.
Установить общие закономерности и особенности дизрегуляции программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов в условиях окислительного стресса in vitro и при остром воспалительном процессе, сопровождающемся нарушением окислительного метаболизма.

Научная новизна.

Впервые с помощью современных молекулярно-биологических методов проведено исследование редокс-чувствительных молекулярных механизмов реализации программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов крови в условиях окислительного стресса in vitro и при остром воспалении.

Впервые при культивировании in vitro мононуклеарных лейкоцитов крови с 1 мМ Н₂О₂ показано, что нарастание продукции активных форм кислорода в клетках сопровождается увеличением содержания апоптотически измененных мононуклеарных лейкоцитов, опосредованным активацией митохондриального и повышенной готовностью клеток к TNFα-рецепторному пути инициации апоптоза. Установлено, что в условиях дисбаланса окислительного метаболизма усиливается фосфорилирование редокс-чувствительных JNK и p38 МАР-киназ, являющихся важным элементом системы сигнальной трансдукции апоптогенных сигналов. Впервые в эксперименте с использованием селективных ингибиторов МАР-киназ показано, что JNK влияет на продукцию IL-8, но не участвует (также как р38) в регуляции синтеза IL-10 в условиях дисбаланса окислительного метаболизма. Факторы транскрипции NF-κB и p53 через механизмы фосфорилирования МАР-киназами и/или непосредственного действия АФК влияют на экспрессию генов, кодирующих белки-регуляторы апоптоза (увеличение экспрессии проапоптотического протеина Вах и антиапоптотичекого Bcl-X_L). Получены приоритетные данные об изменении содержания про- и антиапоптотических белков семейства Bcl-2 в мононуклеарных клетках крови при экспериментальном окислительном стрессе. Изменение соотношения ключевых белков-регуляторов апоптоза семейства Bcl-2 сопряжено с последовательной активацией редокс-чувствительных элементов сигнальной трансдукции (МАР-киназ и факторов транскрипции). Установлены однотипные молекулярные механизмы дизрегуляции программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов крови при экспериментальном окислительном стрессе, индуцированном 1 мМ перекисью водорода, и остром воспалительном процессе. Выявлено, что редокс-чувствительные элементы внутриклеточных сигналпередающих систем являются мишенями для терапевтической коррекции нарушений апоптотической программы клеток.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты проведенного исследования расширяют существующие представления о фундаментальных механизмах дизрегуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов в условиях окислительного стресса. Установлена роль редокс-чувствительных МАР-киназ p38, JNK и факторов транскрипции р53, NF-kB в изменении баланса про- и антиапоптотических белков семейства Bcl-2. Полученные знания носят фундаментальный характер и могут служить основой для разработки молекулярной технологии воздействия на оксидант-опосредованную модуляцию активности ключевых регуляторов апоптоза. Идентифицированные в ходе исследования редокс-чувствительные молекулярные мишени могут быть использованы в разработке подходов селективного управления апоптозом клеток при патологических процессах, патогенез которых сопряжен с развитием окислительного стресса, а также с нарушением реализации летальной программы клеток.

Положения, выносимые на защиту:

1. Усиление программированной гибели мононуклеарных лейкоцитов крови в условиях окислительного стресса сопряжено с активацией митохондрий-опосредованного и повышенной готовностью клеток к TNFα-рецепторному пути инициации апоптоза.

2. В реализацию летальной программы мононуклеарных лейкоцитов при окислительном стрессе вовлечены редокс-чувствительные элементы внутриклеточной сигнальной трансдукции (МАР-киназы р38 и JNK, факторы транскрипции NF-kB и р53).

3. В изменении баланса ключевых белков-регуляторов апоптоза в мононуклеарных лейкоцитах при окислительном стрессе участвуют факторы транскрипции NF-kB и р53, контролирующие экспрессию соответствующих генов.

4. Дизрегуляция апоптоза представляет собой один из компонентов патогенетических изменений при воспалении, сопровождающемся дисбалансом окислительного метаболизма.

Апробация и внедрение результатов работы. Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на Российском медицинском форуме с международным участием «Фундаментальная наука и практика» (Москва, 2006), 5-й научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, 2006), III Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2007), межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицины» (Абакан, 2007), научно-практической конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения» (Санкт-Петербург, 2007).

Исследования поддержаны Советом по грантам при Президенте РФ для поддержки ведущих научных школ РФ в рамках проекта «Молекулярные основы нарушения гомеостаза клеток при актуальных заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы» (НШ-4153.2006.7), РФФИ - «Молекулярные механизмы управления программированной гибелью клеток с использованием регуляторных молекул» (№ 07-04-12150), «Разработка технологии селективного управления внутриклеточными редокс-зависимыми сигнальными системами» (№ 09-04-99026), а также выполнены в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006 годы» (государственные контракты № 02.442.11.7276 от 20.02.2006, № 02.445.11.7419 от 09.06.2006), ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (государственные контракты № 02.512.12.0013 от 01.08.2008, № 02.512.11.2285 от 10.03.2009). Основные результаты диссертационного исследования включены в лекционный курс по патологической физиологии («Патофизиология клетки», «Типовые патологические процессы», «Роль апоптоза клетки в патологии») для студентов лечебного и педиатрического факультетов ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 работ, из них 8 – в центральных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, одна монография в соавторстве.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 219 страницах машинописного текста и состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 471 источник, из них - 122 отечественных и 349 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 46 рисунками.

ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО И КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Регуляцию апоптоза при окислительном стрессе мы рассматривали с позиции существования типовых неспецифических механизмов изменения летальной программы клеток. Для того чтобы понять особенности влияния окислительного стресса на реализацию апоптоза, проводимое нами исследование (в соответствии с поставленными целью и задачами) было разделено на два последовательных этапа.

На первом этапе исследования предстояло выяснить, приводит ли дисбаланс окислительного метаболизма к нарушению реализации летальной программы клеток. Для этого проводили оценку выраженности апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови в условиях оксилительного стресса, состояния ключевых путей инициации программированной гибели клеток (рецепторный, митохондрий-опосредованный, ядерный).

На втором этапе исследования предполагалось проверить гипотезу о вовлечении редокс-чувствительных элементов сигнальной трансдукции в механизмы нарушения летальной программы клеток при окислительном стрессе. Для определения роли митоген-активированных протеинкиназ р38 и JNK в регуляции апоптоза клеток при окислительном стрессе использовали селективные ингибиторы МАР-киназ (ML3403 и SP600125), определяли наличие общих и фосфорилированных форм МАР-киназ, транскрипционных факторов р53 и NF-kB, фосфорилированного р53. Для определения участия протеинов семейства Bcl-2 в регуляции апоптоза измеряли внутриклеточное содержание про- (Вах, Bad) и антиапоптотических (Вcl-2, Bcl-X_L) представителей данного семейства белков (табл. 1). Затем оценивали экспрессию генов белков-регуляторов апоптоза, находящихся под транскрипционным контролем р53 и NF-kB.

Для верификации молекулярных мишеней, ответственных за редокс-зависимую модуляцию апоптоза мононуклеарных лейкоцитов крови, проводилось манипулирование in vitro мононуклеарными лейкоцитами крови, полученными у здоровых доноров и больных острыми воспалительными заболеваниями.

В исследование были включены 46 здоровых доноров в возрасте от 18 до 50 лет (мужчины - 20, женщины – 26) и 49 больных (25 мужчин и 24 женщины в возрасте от 18 до 50 лет, средний возраст – 32±3 лет) с острыми воспалительными заболеваниями (внебольничная пневмония, острый аппендицит). Критериями исключения из программы исследования для здоровых доноров и больных острыми воспалительными заболеваниями являлись: возраст моложе 18 и старше 50 лет; период обострения хронических воспалительных заболеваний; аутоиммунные, наследственные и психические болезни, злокачественные новообразования, алкогольная и наркотическая зависимости; отсутствие информированного согласия.

Пациенты были обследованы при госпитализации в терапевтическое и хирургическое отделения ММЛПУ Городская больница №1 (главный врач - С.М. Кирютенко), госпитальные клиники ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (главный врач – Заслуженный врач РФ, канд. мед. наук В.М. Шевелев), клиники Военно-медицинского института МОРФ (зав. кафедрой терапии и усовершенствования врачей – канд. мед. наук, доцент Т.С. Агеева).

Материалом для исследования служила венозная кровь, взятая утром натощак из локтевой вены в количестве 10 мл и стабилизированная гепарином (25 Ед/мл).

Исследование проводилось на базе Межкафедральной научно-образовательной лаборатории молекулярной медицины ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (руководители – д-р мед. наук, проф. Н.В. Рязанцева, акад. РАМН В.В. Новицкий), лаборатории фармакогеномики НИИ химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск) (зав. лабораторией – канд. мед. наук М.Л. Филипенко).

Мононуклеарные лейкоциты выделяли из крови путем центрифугирования на слое фиколла (“Pharmacia” Швеция) плотностью 1,077 и инкубировали в течение 18 ч при температуре 37ºС в полной питательной среде. Для определения роли митоген-активированных протеинкиназ р38 и JNK в регуляции апоптоза мононуклеарных лейкоцитов при окислительном стрессе использовали селективные ингибиторы МАР-киназ (ML3403 и SP600125 («Biosource», США) соответственно). Для индукции окислительного стресса в клеточные культуры добавляли перекись водорода в различных концентрациях (10 мкм, 50 мкм, 100 мкм, 500 мкм и 1 мМ). Методом проточной лазерной цитофлуориметрии с использованием цитометра Epics XL («Beckman Coulter», Франция) оценивали уровень внутриклеточной продукции АФК, количество апоптотически измененных клеток, содержание мононуклеарных лейкоцитов со сниженным трансмембранным митохондриальным потенциалом и число TNFR1-презентирующих клеток. Оценку реализации апоптоза мононуклеарных лейкоцитов проводили с использованием ФИТЦ-

меченного аннексина V («ANNEXIN V FITC» («Beckman Coulter», Франция)), обладающего сродством к мембранно-связанному фосфатидилсерину [Van Engeland M., 1998]. Для подтверждения наличия в

Таблица 1

Распределение здоровых доноров и пациентов с острыми воспалительными заболеваниями, в соответствии с проведенными методами исследования

Методы исследования	Группы обследованных (условия эксперимента)
	Здоровые доноры			Больные с острым воспалением
	Интактные клетки	Культивирование клеток in vitro с 10, 50, 100, 500 мкМ, 1мМ и 5мМ Н₂О₂	Культивирование клеток in vitro с 1мМ Н₂О₂ и селективными ингибиторами p38 ML3403 и JNK SP600125	Культивирование клеток, полученных у больных с острыми воспалительными заболеваниями (внебольничная пневмония и острый аппендицит)	Культивирование клеток у больных с острыми воспалительными заболеваниями и селективными ингибиторами p38 ML3403 и JNK SP600125
1	2	3	4	5		6
Оценка апоптоза мононуклеарных лейкоцитов в аннексиновом тесте с использованием проточной лазерной цитофлуориметрии	34	82	Не опреде-ляли	49		Не опреде-ляли
Определение уровня АФК в клетках с использованием проточной лазерной цитофлуориметрии	34	82	68	49		98
Оценка уровня митохондриального трансмембранного потенциала с использованием проточной лазерной цитофлуориметрии	34	82	Не опреде-ляли	49		Не опреде-ляли
Определение количества TNFR1-презентирующих клеток с использованием проточной лазерной цитофлуориметрии	18	18	Не опреде-ляли	49		Не опреде-ляли
Определение содержания общих и фосфо-форм МАР-киназ (JNK, p38) и фосфорилированного р53 методом вестерн-блоттинга	4	4	4	4		4

Продолжение таблицы 1

1	2	3	4	5	6
Исследование содержания факторов транскрипции (p53 и NF-kB) и белков-регуляторов апоптоза (Bad и Bcl-X_L) с использованием метода вестерн-блоттинг	4	4	Не опреде-ляли	4	Не опреде-ляли
Исследование содержания белков-регуляторов апоптоза (Bax и Bcl-2) с использованием метода вестерн-блоттинг	4	4	4	4	4
Оценка экспрессии мРНК генов белков-регуляторов апоптоза (bad, bax, bcl-2, bcl-X_L) с использованием метода ПЦР в реальном времени	12	12	Не опреде-ляли	7	Не опреде-ляли
Исследование содержания IL-8, IL-10 и TNFα в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов методом иммуноферментного анализа	11	11	22	22	22
Определение количества апоптотически измененных клеток TUNEL-методом	Не опреде-ляли	Не опреде-ляли	Не опреде-ляли	10	Не опреде-ляли

исследуемой культуре клеток с апоптотическими изменениями применяли TUNEL-метод («Webstain», США). Количество клеток со сниженным уровнем потенциала митохондриальных мембран (∆ψ) регистрировали с использованием набора реагентов «MitoScreen» («BD Pharmigen», США). Уровень активных форм кислорода в клетках оценивали с помощью красителя с заблокированной флуоресценцией – дихлорфлюоресцеина диацетата («Sigma», США). Содержание мононуклеарных лейкоцитов, презентирующих на своей поверхности мембранную форму рецептора к фактору некроза опухоли-α 1-го типа (TNF-RI), определяли с помощью стандартных моноклональных антител к TNF-RI, меченных ФИТЦ («Immunotech», Франция).

Продукцию мононуклеарными лейкоцитами TNFα оценивали с помощью иммуноферментного анализа по инструкции, предлагаемой фирмой-производителем тест-систем («Протеиновый контур», Россия). В супернатантах интактных, перекись-стимулированных и культивированных с ингибиторами МАР-киназ культур мононуклеарных лейкоцитов определяли содержание IL-8 и IL-10, используя метод иммуноферментного анализа в соответствии с инструкцией к набору («Biosurce», USA) на микропланшетном фотометре Multiscan EX («ThermoLabSistems», Финляндия). Концентрации TNFα, IL-8 и IL-10 вычисляли по калибровочной кривой.

Для определения содержания активных и неактивных форм МАР-киназ р38, JNK, транскрипционных факторов (NF-kB, p53 и фосфо-формы р53) и белков-регуляторов апоптоза (Bcl-2, Bcl-X_L, Bax, Bad) был использован метод вестерн-блоттинга. Клеточные экстракты получали путем лизиса клеток. Белки разделяли по молекулярной массе под действием электрического поля в течение 60 мин при напряжении 120 В. Для последующего исследования белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану («Bio-Rad», США). Перенос белков осуществлялся электрофоретически в течение 90 мин при силе тока 60 мА. Нитроцеллюлозные блоты инкубировали с первичными антителами к активным и общим формам МАР-киназ (JNK 1 и 2, р38, фосфо JNK 1 и 2, фосфо р38), факторам транскрипции (р53 («Biosource», США), NF-kB («Biosource», США)), к фосфо-форме р53 («Biosource», США) и белкам-регуляторам (Bax («Biosource», США), Bcl-X_L («Sigma», США), Bad («Biosource», США), Bcl-2 («Biosource», США)) в разведении 1:200. В качестве стандарта и внутреннего контроля использовали белок глицеро-3-фосфат-дегидрогеназу («Chemicon», США).

Для количественного определения экспрессии РНК генов bcl-2, bax, bcl-X_L и bad использовали метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Выделение РНК из мононуклеаров крови осуществляли с применением гуанидин изотиоционата с последующей фенол-хлороформной экстракцией [Chomczynski P., Sacchi N., 1987]. Оценку качества выделенного препарата РНК проводили по итогам электрофоретического разделения. Возможные примеси геномной ДНК удаляли при помощи переосаждения в 2,5 М LiCl. Следующим шагом синтезировали ДНК на матрице РНК при участии обратной транскриптазы. Полученный фрагмент ДНК амплифицировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени с использованием SYBR Green I («Мolecular Probe», США) на амплификаторе IQ5 («Bio-Rad», США). Амплификацию проводили с использованием режима, предполагающего предварительную денатурацию образцов (95°С, 2 мин) с последующими сорока циклами, включающими денатурацию (95°С, 15 сек) и отжиг (60°С, 45 сек). Праймеры, позволяющие специфично амплифицировать фрагменты кДНК генов bcl-2, bcl-X_L, bax и bad, были предоставлены лабораторией фармакогеномики НИИ химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск). Для определения относительного количества кДНК в образце использовали критерий ddCt.

При оценке полученных данных использовали методы статистического описания и проверки статистических гипотез [Лакин Г.Ф., 1980]. Для каждой выборки вычисляли средневыборочные характеристики: среднее арифметическое, среднее квадратичное отклонение, ошибка среднего или медиана, первый и третий квартили. Проверку нормальности распределения количественных показателей проводили с использованием критерия Колмогорова-Смирнова. При соответствии нормальному закону распределения признака в исследуемых выборках проверку гипотезы о равенстве средних выборочных величин проводили с использованием t-критерия Стъюдента. В случае отсутствия согласия данных с нормальным распределением для оценки различий между зависимыми выборками применяли непараметрический критерий Вилкоксона. Для оценки достоверности различий независимых выборок использовали ранговый критерий Манна-Уитни. Наличие связи между изученными показателями проводили с использованием корреляционного анализа по методу Спирмена. Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05 [Лакин Г.Ф., 1980; Гланц С., 1999].