Клеточные и гуморальные механизмы опухолеспецифической иммунотерапии и их модуляция под влиянием гипертермии
|
Скачать 330.65 Kb.
|
|
Оценка средней продолжительности жизни. Средняя продолжительность жизни вычислялась по формуле: СПЖ=(∑хNxD)/Mt, где N-количество животных, D-количество дней, Mt-общее количество животных в группе. Результаты по выживаемости мышей с меланомой представлены медианой, с указанием ошибки среднего. Процент увеличения продолжительности жизни животных вычисляли по формуле: средняя продолжительность ___ средняя продолжительность жизни жизни в контрольной группе в опытной группе УПЖ= _________________________________________________________ Х 100 средняя продолжительность жизни в контрольной группе Определение концентрации цитокинов в сыворотке крови. Сыворотка была пулирована от 5 мышей каждой группы в трех сериях экспериментов. Определение проводили стандартно с помощью иммуноферментных тест-систем, согласно инструкции фирмы производителей (BioSource, Intrenational, Inc. USA). Фотометрию проводили на ELISA-процессоре фирмы ,,Labsystems Multiskan MS” при длине волны 450 нм. Гистологическое исследование опухолевых образцов. Фрагменты опухоли, размером не более 5х5х5 мм забирали на 20 сутки после перевивки и фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина не менее 24 часов, обезвоживали в серии этанола возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заключали в парафин. Для гистологического исследования срезы опухоли толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Препараты исследовали на световом микроскопе «Triton» (Seti, Бельгия) при увеличении Х 600 [Пирс Э., 1964; Лилли P., 1969; Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996]. Оценка лейкоцитарной инфильтрации и степени некроза/апоптоза в опухолевых образцах проводилась по пятибалльной оригинальной шкале д.м.н. И.В. Майбородина. Определение уровня апоптоза и анализ клеточного цикла. Анализ клеточного цикла и уровень апоптоза после гипертермического воздействия для опухолевых клеток проводился через 24 часа, для спленоцитов – через 72 чача. Анализируемые клетки однократно отмывали забуференным физиологическим раствором, содержащим 0,02% ЭДТА и 1% азида Na (раствор 1) и затем фиксировали в течение 30 минут холодным 1% раствором параформальдегида. Фиксированные клетки центрифугировали, осадок ресуспендировали в 1 мл раствора 1, содержащего пропидиум иодид (Propidium iodide, Sigma, США) в конечной концентрации 50 мкг/мл и РНКазу (Sigma, США) в концентрации 20 мкг/мл, после чего образцы клеток инкубировали в темноте, в течение 30 минут при 37°C. Анализ клеточного цикла и уровня апоптоза проводили на основании измерения содержания ДНК методом проточной цитофлюорометрии с использованием лазерного клеточного сортера-анализатора FACSCalibur (Becton Dickinson, США). Процентное содержание апоптотических клеток и клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла, рассчитывалось по одномерной гистограмме красной флуоресценции клеток, которые формировали пики в соответствии с плоидностью ДНК. Электрофоретический анализ белков. Электрофоретическое разделение белков проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970) в прерывистой буферной системе в присутствии 0.1% ДСН в трис-глициновом буфере. Разделяющий гель, имеющий pH 8.8, содержал 0.375 М Трис-HCl, , 0.1% ДСН, 12% акриламида, 1% N',N-метиленбисакриламида (80% объема геля); концентрирующий гель - 0.125 М Трис-HCl, pH 6.8, 0.1% ДСН, 4% акриламида, 0.5% N',N-метиленбисакриламид. Белковые пробы вносили в ПААГ в лизирующем буфере. Пробы прогревали 5 мин при 95°С. Электрофорез проводили в режиме 10 В/см. Гель окрашивали в красителе Coomassi Brilliant Blue R-250 в 20% этаноле, 10% уксусной кислоте. Краситель отмывали кипячением в дистиллированной воде. Вестерн-блот анализ. Антигенные белки разделяли электрофоретически в 12% ПААГ-ДСН и затем переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Towbin H., et al., 1979), которую после блокирования сайтов неспецифического связывания раствором 3% БСА инкубировали с соответствующими рекомбинантными антителами. Связавшиеся фаговые антитела проявляли поликлональными анти-М13 антителами сыворотки кролика (в разведении 1:16000), а в случае растворимых антител – мышиными anti-C-myc МКА, с последующим добавлением конъюгата щелочной фосфатазы с антимышиными антителами в разведении 1:4000, а в случае полноразмерных антител – анти-human IgG1 конъюгатом щелочной фосфатазы в разведении 1:10000. Визуализацию иммунных комплексов проводили, добавляя 5-бромо-3-индолил фосфат и нитро-тетразолиевый голубой. Статистический анализ данных. Данные по выживаемости животных представлены в виде медианы выживаемости с указанием ошибки среднего. Статистическую обработку данных по выживаемости проводили с использованием критерия Каплана-Майера. Остальные результаты представлены в виде средних значений с указанием стандартных отклонений. Достоверность данных оценивали с помощью критерия Вилкоксона-Манна-Уитни для непараметрических величин. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ. Влияние вакцинации и гипертермического воздействия на среднюю продолжительность жизни мышей с меланомой. В табл. 1 представлены данные по средней продолжительности жизни мышей с меланомой после применения сингенной, ксеногенной вакцины, гипертермического воздействия и его комбинации с вакцинотерапией. Таблица 1 Средняя продолжительность жизни мышей с меланомой (n=10)
Примечание: *P<0,01- различия достоверны по сравнению с контрольной группой (критерий Каплана-Майера). Отмечено статистически значимое увеличение средней продолжительности жизни на 23%, по сравнению с контролем в группе животных, получавших только ксеновакцину, а также в группе ксеновакцинированных мышей с предварительно проведенным гипертермическим воздействием на 26%. Достоверного различия между данными по этим двум группам выявлено не было. Во всех остальных группах выживаемость не отличалась от таковой в контроле. Использование гипертермического воздействия после курса ксеновакцинации, отменяло эффект вакцинотерапии. Изучение реактивности спленоцитов на стимуляцию антигенами меланомы. По данным литературы реакция пролиферации спленоцитов в экспериментальных моделях позволяет оценить уровень сенсибилизации иммунизированных мышей [Гольдберг Е.Д., 1992]. Мы изучали пролиферативный ответ спленоцитов мышей на стимуляцию антигенами сингенной меланомы В16 на 14 сутки после привития опухоли. Статистически значимое увеличение индекса стимуляции пролиферации лимфоцитов по сравнению с контролем на антигены сингенной меланомы В16 имел место только в группе мышей, иммунизированных сингенной вакциной. Интересно, что применение гипертермического воздействия с сингенной вакциной в различных вариантах, отменяло прирост пролиферации. Использование ксеновакцинации, наоборот, снижало уровень пролиферации, хотя и на уровне тенденции. Гипертермическое воздействие не оказывало влияния на уровень пролиферации (табл.2). Таблица 2 Индекс стимуляции спленоцитов в ответ на антигены меланомы мыши В16 (n=9).
Примечание: *PU<0,01- различия достоверны по сравнению с контрольной группой (U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни). Таким образом, сингенная вакцинация приводила к статистически значимому увеличению пролиферативного ответа на антигены меланомы В16, что может косвенно указывать на активацию Th1 звена иммунитета, однако, это не ассоциируется с увеличением выживаемости мышей этой группы. Полученные данные не согласуются с мнением большинства исследователей о ведущей роли CTL-опосредованного иммунитета в эффекте противоопухолевой вакцинации [Trapani J.A., 2002; Pardoll D., 2002; Галактионов В.Г., 2005]. Однако, на основании имеющихся данных можно полагать, что опосредуемый Th1 клеточный иммунитет может быть эффективен в предотвращении опухолевого роста на ранних стадиях болезни, когда количество патологических клеток не превышает определенного значения, а используемая нами концентрация вакцины, эквивалентная 5х105 опухолевых клеток на мышь, предполагает исследование противоопухолевых реакций на продвинутых стадиях развития заболевания. Определение уровня цитокинов в сыворотке крови мышей с меланомой. Известно, что IFN-γ является основным эффекторным цитокином, продуцируемым Тh 1-го типа, ответственными за развитие клеточных иммунных реакций [Sioud M., 2003; Kochenderfer J.N., 2007]. Биологические эффекты IL-4 связаны с его основной функцией – направлять развитие иммунного ответа по Th 2 пути [Кагидзе З.Г., 2003]. Поэтому, уровни этих цитокинов в крови имеют большое значение при оценке иммунного статуса организма и могут свидетельствовать о генерации клеточных или гуморальных иммунных реакций. Таблица 3 Уровень цитокинов в сыворотке крови мышей с меланомой В16 (пг/мл, n=5).
Содержание IFN-γ и IL-4 в сыворотке крови контрольных мышей не превышало минимальной определяемой концентрации (1пг/мл и 5 пг/мл, соответственно). У мышей, получавших отдельно сингенную вакцину или гипертермическое воздействие, содержание INF-γ было повышенным. Совместное применение гипертермического воздействия и сингенной вакцинации в различных вариантах не приводило к увеличению уровня INF-γ. IL-4 определялся только в группе ксеновакцинированных животных в концентрации 6,2 ± 0,8 пг/мл. При комбинации гипертермического воздействия с ксеновакцинотерапией не зафиксировано повышения уровня INF-γ или IL-4 (табл.3). Полученные данные подтверждают наше предположение о развитии иммунного ответа по Th1 типу в случае иммунизации мышей с меланомой сингенной вакциной. В то же время повышение сывороточного IL-4 в группе ксеновакцинированных мышей, а также отсутствие в этой группе животных прироста индекса пролиферации спленоцитов на антигены меланомы, возможно, свидетельствует о развитии Th2 ответа. Определение IgG антител в сыворотке крови мышей с меланомой. В процессе опухолевой прогрессии, при угнетении или отсутствии киллерного эффекта Т-лимфоцитов деструкция трансформированных клеток может осуществляться за счет цитотоксичности, опосредованной гуморальными антителами [Агеенко А.И., 1982]. Учитывая, что в наших экспериментах увеличение средней продолжительности жизни мышей с меланомой после курса ксеновакцинотерапии связано с увеличением уровня сывороточного IL-4, логично предположить, что значимая роль в сдерживании опухолевого процесса может принадлежать опухолеспецифическим антителам. Поэтому, с целью выявления возможных сывороточных опухолеспецифических антител, был проведен вестерн-блотт анализ. Было показано, что иммунизация мышей с меланомой ксеногенной вакциной вызывает образование IgG антител, специфичных к белку меланомы с молекулярной массой около 70 кД, содержащемуся в меланоме В16 и Bro, тогда как сингенная вакцина не способна индуцировать выработку таких антител. Таким образом, ксеновакцинация мышей с меланомой приводит к повышению сывороточного IL-4, индуцирует синтез IgG антител, специфичных к антигену меланомы и пролонгирует выживаемость экспериментальных животных. В настоящее время роль гуморального звена в противоопухолевой защите организма не до конца ясна. Считается, что противоопухолевые антитела в одних случаях оказывают защитное действие, в других - содействуют прогрессивному росту злокачественных опухолей [Ravindranath M.H., 1998; Habal N., 2001; Игнатов П.Е., 2002]. Опухолеспецифические антитела связываются с антигенами опухолевых клеток, однако фонового уровня комплемента часто недостаточно для развития антителозависимого лизиса опухолевых клеток. Этому, в частности, может способствовать высокая экспрессия на опухолевых клетках молекул, препятствующих цитолитическому действию комплемента. Считается, что опсонизация опухолевых клеток антителами в определенных случаях приводит к блокаде опухолевых антигенов и недоступности их для рецепторов CD8 Т-киллеров. Другой механизм защиты опухоли связан со сбрасыванием опухолевыми клетками со своей поверхности комплексов антиген-антитело [Петров Р.В., 1987; Ravindranath M.H., 1998; Барышников А.Ю., 2004]. Как известно, цитотоксичность, опосредованную антителами, осуществляет целый ряд клеток, играющих важную роль в противоопухолевом ответе и обеспечивающих местные защитные реакции, проходящие в тканях. В связи с этим было проведено гистологическое исследование опухоли мышей с меланомой на фоне проводимой терапии. Гистологическое исследование образцов опухоли. Большая часть солидных опухолей имеет в своем составе инфильтраты из различных типов клеток. Опухолевая инфильтрация макрофагами, по литературным данным, связана, обычно, с негативным прогнозом, тогда как инфильтрация опухоли нейтрофилами ассоциируется с благоприятным исходом заболевания [Pekarek L.A., 1995; Satomi A., 1995; Carlo E.D., 2001; Talmadge J.E., 2007]. Лимфоидная инфильтрация в опухолевом узле также рассматривается как благоприятный прогностический фактор [Carlo E.D., 2001; Yu J., 2001]. Гистологическое исследование показало наличие высокой степени некроза/ апоптоза и инфильтрации опухоли нейтрофилами и лимфоцитами в группах мышей, иммунизированных сингенной или ксеновакциной и в группе мышей «ГТ+ ксеновакцина» (табл. 4). Таблица 4 |
Похожие:
 |
Содержание ... |
 |
Джон Колеман Комитет 300. Тайны мирового правительства Бывшие и ныне действующие учреждения и организации комитета 300, а также те, которые находятся под непосредственным его влиянием |
|
Джон Колеман Комитет 300. Тайны мирового правительства Бывшие и ныне действующие учреждения и организации комитета 300, а также те, которые находятся под непосредственным его влиянием |
|
Основы физической культуры Физическая культура Физическая культура воздействует на жизненно важные стороны индивида, полученные в виде задатков, которые передаются генетически... |
|
Инструкция к заданиям первого, практического тура Продолжительность жизни хвои у сосны составляет 3-4 года; за это время она накапливает такое количество сернистого газа, которое... |
|
1Требования к средствам индивидуальной защиты органа слуха Высокий уровень шума на производстве – вредный производственный фактор. Под его влиянием нарушается сложная регулирующая функция... |
|
Данный метод может применяться для измерения концентраций свободного... Т4 не имеет собственной активности, а служит только в качестве прогормона для Т3 Циркулирующие уровни Т3 находятся под влиянием изменений... |
|
Санитарно-эпидемиологические правила сп 3 3332-16 Илп, предназначенных для иммунопрофилактики, иммунотерапии и диагностики болезней и аллергических состояний, при их транспортировании... |
|
На процесс формирования когнитивных карт пространства Оценка искажений пространственных представлений проводилась при помощи метода отображения и анализа карт-обзоров пространства. Результаты... |
|
Конвенция о безопасности и гигиене труда и производственной сфере (Конвенция 155) Работодатели должны обеспечивать, насколько это обоснованно и практически осуществимо, чтобы находящиеся под их контролем рабочие... |
|
Американские врачи солидарны с отечественными в том, что тамифлю... Да и врачи из фирмы-производителя также не сомневаются в этом. Подобная статистика привела к тому, что в Стране Восходящего Солнца... |
|
Ильин В. А. И 49 Археология детства: Психологические механизмы семейной жизни И 49 Археология детства: Психологические механизмы семейной жизни — М.: Независимая фирма “Класс”, 2002. — 208 с. — (Библиотека психологии... |
|
Настройка телевизионных приёмников некоторых моделей и dvb-c приставки... Настраиваем параметры "Частота начала 474000", "Частота окончания 498000", "Модуляция 128qam" и "Скорость передачи 6975" |
|
Список частот цифрового вещания: Частота: 770 mhz Модуляция: 256qam... Для настройки встроенного dvb-c тюнера для приема программ цифрового кабельного телевидения необходимо использовать следующие параметры... |
|
Диссертация на тему: Организационно-педагогические механизмы формирования... На тему: «Организационно-педагогические механизмы формирования многоуровневой модели непрерывного профессионального образования в... |
|
Инструкция по технике безопасности перед началом работы необходимо... Ется использовать инструмент со снятой крышкой или отвернутыми винтами ее крепления. Если крышка и винты были предварительно демонтированы,... |