Клеточные и гуморальные механизмы опухолеспецифической иммунотерапии и их модуляция под влиянием гипертермии

Степень лейкоцитарной инфильтрации и некротических/апоптотических изменений опухоли (n=5). № п/п Вид воздействия Инфильтрация Степень гибели клеток 1 Контроль 1 1 2 ГТ 1 2 3 Сингенная вакцинация 4 4 4 Сингенная вакцинация + ГТ 3 3 5 ГТ + сингенная вакцинация 1 1 6 Ксеновакцинация 4 4 7 Ксеновакция + ГТ 1 2 8 ГТ + ксеновакцинация 4 4 -5 Интересно, что в тех опытных группах, для которых было показано статистически значимое увеличение выживаемости («ксеновакцинация», «ГТ+ксеновакцинация») большая часть клеток, инфильтрирующих опухолевые узлы, была представлена нейтрофилами. В остальных группах соотношение между нейтрофилами и лимфоцитами было приблизительно одинаковым. Поскольку в наших исследованиях ксеновакцинотерапия ассоциируется с повышением уровня лейкоцитарной (нейтрофилы) инфильтрации опухоли и увеличением выживаемости мышей с меланомой, можно предположить, что основную эффекторную роль в разрушении клеток опухоли играет неспецифическое звено. С. Bogdan (2000) показал, что цитотоксические агенты нейтрофилов способны не только контролировать опухолевый рост, но также ингибировать пролиферацию Т-лимфоцитов, как непосредственным образом, так и за счет супрессии функции макрофагов. Этим может частично объясняться отсутствие стимуляции пролиферации спленоцитов, полученных от ксеновакцинированных мышей, в присутствии сингенных меланомных антигенов. Полученные результаты однозначно указывают на выраженную способность гипертермического воздействия супрессировать противоопухолевые иммунные реакции: ГТ 420С практически полностью отменяла эффекты ксеновакцины, связанные с увеличением средней продолжительности жизни мышей с меланомой, повышением степени лейкоцитарной инфильтрации опухоли и уровнем сывороточного IL-4. Ингибирующее влияние ГТ на иммунные процессы проявлялось тогда, когда ГТ применялась после вакцинотерапии. Это не наблюдалось в том случае, если вакцинотерапия проводилась после ГТ. Эти данные указывают на то, что иммуносупрессорное действие ГТ является относительно кратковременным и обратимым. В связи с этим возникают вопросы: 1) способна ли ГТ оказывать токсическое действие на опухоль, и не влиять при этом на функциональную активность иммунокомпетентных клеток, 2) насколько плюсы позитивного действия ГТ могут превалировать над минусами ее иммунодепрессивного действия? Исследуемый нами режим ГТ в системе in vivo, является пороговым и его превышение приводит к летальному исходу, не связанному с развитием опухолевого процесса. Чтобы ответить на вопрос о непосредственном влиянии ГТ на разные типы клеток, следующий этап наших экспериментов был выполнен в системе in vitro с использованием изолированных иммунокомпетентных и опухолевых клеток. Влияние гипертермического воздействия на опухолевые и лимфоидные клетки в системе in vitro. В жизненном цикле выделяют периоды повышенной чувствительности к действию высоких температур, которые характерны как для нормальных, так и для трансформированных клеток. Известно, что наиболее чувствительны к гипертермическому воздействию, клетки, находящие в фазе синтеза или митоза, в то время как находящиеся в фазах G0/G1 относительно устойчивы к нагреванию. В экспериментальных работах определено, что температура 430С и выше, является непереносимой для культур опухоли, в то время как клетки здоровых тканей выдерживают температуру до 450С [Фрадкин С.З., 2004]. Различия в толерантности опухолевых и нормальных клеток могут быть связаны с тем, что большинство клеток опухолевой популяции находится в фазе митоза, а у изолированных из организма нормальных клеток только приблизительно 10-20 % вступают в процесс пролиферации [Yuguchi T., 2002]. После активации лимфоцитов митогеном (Con А) в течение 48 часов происходит изменение соотношения фаз клеточного цикла в популяции. Количество клеток, находящихся в фазе S/M, увеличивается до 69%, приближаясь к аналогичному показателю опухолевых клеток. В дальнейших экспериментах культуры опухолевых клеток, интактных и активированных спленоцитов подвергали гипертермическому воздействию при температуре 390, 410, 42,50 или 43,50С и затем оценивали их пролиферативную активность. При этом, контрольная температура составила 370С. Нами зафиксировано, что различия в пролиферативной активности исследуемых культур клеток начинаются с температурной точки 42,5 0 С. Повышение температуры до 42,50С приводит к 70% снижению реакции пролиферации относительно контроля (370С) предварительно активированных Con А спленоцитов. Опухолевые клетки меланомы В16, также как и интактные спленоциты, более устойчивы к температурному воздействию 42,50С, т.к. существенно не снижают своей пролиферативной активности при данной температуре. Повышение температуры до 43,50С, ведет к драматическому снижению пролиферации относительно контрольной температуры 370С всех исследуемых культурах. Как уже было отмечено, фаза клеточного цикла значительно влияет на уровень апоптоза, индуцированного тепловым шоком [Hall E.J., 1984; O,Neill K.L., 1998; Фрадкин С.З., 2004]. При постепенном увеличении тепловой нагрузки от 370С до 490С, наблюдается постепенное увеличение уровня апоптоза со значительным изменением от апоптоза до некротической гибели [O,Neill K.L., 1998]. При определении процента апоптотических клеток в исследуемых культурах, было установлено, что повышение температуры до 390, 42,50 и 43,50, приводит к статистически значимому увеличению изученного показателя в популяции активированных спленоцитов в 3, 4 и 5 раз, соответственно. У интактных спленоцитов отмечено увеличение уровня апоптоза при температуре 42,50 и 43,50 в 1,6 и 2,1 раза. Интересно, что в опухолевых клетках повышение температуры не вызывало увеличение апоптоза (табл. 5). Таблица 5 Влияние гипертермического воздействия на уровень апоптоза в изученных культурах. t0 Интактные спленоциты (X ± m, %) Активированные спленоциты (X ± m, %) Клетки В16) (X ± m, %) 370 0,2±0,4 0,9±1,1 0 390 0,2±0,4 3,1±1,9 * 0 42,50 1,6±0,7 * 4,1±0,8 * 0 43,50 2,1±0,3 * 5±1,6 * 0 Примечание: *PU<0,01- различия достоверны по сравнению с контролем 370С (U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни). При изучении влияния ГТ на клеточный цикл, обнаружено, что гипертермическое воздействие 42,50 и 43,50С, увеличивало в культуре активированных спленоцитов процент клеток, находящихся в фазе G0/G1. В то же время, не отмечено существенного влияния на соотношение фаз клеточного цикла, как в культуре интактных спленоцитов, так и в культуре опухолевых клеток (табл. 6). Поскольку температура 42,50С является критической для всех исследуемых клеток, представляло интерес оценить возможность восстановления пролиферативного потенциала лимфоидных и опухолевых клеток после гипертермического воздействия. На рисунке 1 представлено сравнительное изменение в течение 7 суток наблюдения индекса пролиферации опухолевых клеток и активированных спленоцитов. Пик пролиферации клеток опухоли В16 после температурного воздействия приходился на третьи сутки культивирования, в то время как пик пролиферации спленоцитов регистрировался на 5 сутки культивирования. Таблица 6 Влияние ГТ на соотношение фаз клеточного цикла в изученных культурах. Активированные спленоциты t0 S/M (%) G0/G1 (%) 370 39,2±5,9 59,9±5,7 390 39,9±6,4 56,8±7,3 42,50 4,6±2,7 * 91,3±2,7 * 43,50 3,8±1,8 * 91,2±2,2 * Интактные спленоциты t0 S/M (%) G0/G1 (%) 370 6,7±2 92,2±2,1 390 7,9±2 91,9±1,6 42,50 8,7±2,9 89,7±3,2 43,50 6,8±1,8 91,1±1,8 Клетки опухоли В16 t0 S/M (%) G0/G1 (%) 370 41 ± 4 59 ± 4 390 49 ± 3 51 ± 3 42,50 56 ± 5 44 ± 5 43,50 43 ± 5 57 ± 5 Примечание: *PU<0,01- различия достоверны по сравнению с контролем 370С (U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни). Рис 1. Динамика пролиферативной активности клеток меланомы В16 и активированных Соn A спленоцитов после гипертермического воздействия (42,5 0 С); *PU<0,01 (U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни). Таким образом, показано, что опухолевые клетки имеют приоритетные возможности по сравнению с лимфоидными клетками в восстановлении своего пролиферативного потенциала после гипертермического воздействия. В целом, полученные данные свидетельствуют, что температура разогрева в диапазонах 42,50- 43,50С не оказывает прямого повреждающего воздействия на всю популяцию опухолевых клеток, тогда как у активированных лимфоидных клеток в этом температурном диапазоне не только увеличивается процент апоптотических клеток, но и происходит задержка прохождения клетками S/M фаз клеточного цикла, связанная, вероятно, с остановкой в фазе G0. Это входит в определенное противоречие с опубликованными ранее данными о повышенной чувствительности опухоли к ГТ, и обосновывающими применение системной ГТ в онкологической практике [Мардынский Ю.С., 2001; Осинский С. П., 2002; Yuguchi T., 2002; Фрадкин С.З., 2004]. С другой стороны, наши результаты согласуются с экспериментальными и клиническими исследованиями, свидетельствующими, что ГТ способна оказывать выраженный противоопухолевый эффект только при очень высоких (440-450С) температурах. Однако ГТ в таких диапазонах ведет к перегреву всего организма, развитию осложнений и впоследствии к прогрессии основного заболевания [O’Neill K.L., 1998; Falk M.H., 2001; Akria Ito, 2003]. При анализе противоречий, связанных с клиническим применением ГТ, следует, однако, иметь в виду, что термочувствительность опухоли может быть связана не столько с особенностями клеток, ее формирующих, сколько с особенностями ее кровотока [Маянский А.Н., 2004; Гафтон Г.И., 2004]. Низкий кровоток и связанная с этим низкая теплоотдача, наряду с кислой средой и недостатком питания – это факторы, способные повышать чувствительность опухоли к ГТ. В системе in vitro значимость этих факторов нивелирована, и это следует иметь в виду при экстраполяции на организм полученных данных. ВЫВОДЫ: 1) Введение ксеногенной полиантигенной противоопухолевой вакцины статистически значимо увеличивает продолжительность жизни мышей с перевиваемой меланомой. В аналогичных условиях сингенная вакцинация не обладает такой способностью. Использование кратковременного гипертермического воздействия в сочетании с вакцинотерапией или в качестве моновоздействия, не оказывает значимого влияния на выживаемость мышей с меланомой. 2) Ксеновакцинотерапия индуцирует повышение уровня IL-4 в сыворотке крови животных-опухоленосителей. Сингенная вакцинация вызывает повышение уровня сывороточного IFN-γ и сопровождается усилением пролиферативного ответа спленоцитов на антигены меланомы В16. Эти данные свидетельствуют, что ксеновакцинация и аутовакцинация индуцируют качественно разные типы иммунных реакций по Тh 2 и Th1 типу, соответственно. 3) Ксено- и сингенная вакцинотерапия способствуют усилению инфильтрации опухоли нейтрофилами, моноцитами и лимфоцитами, что коррелирует с выраженностью некроза/апоптоза опухолевых клеток, и свидетельствует об активации специфического и неспецифического звеньев иммунитета. Гипертермическое воздействие частично отменяет данное действие вакцин. 4) Ксеновакцинация сопровождается формированием в сыворотке крови антител класса IgG к антигену меланомы В16 с молекулярной массой 70 кД, что подтверждает индукцию ксеновакциной иммунных реакций преимущественно опосредуемых Th2 типа. При использовании сингенной вакцины специфические антитела к антигену меланомы В16 не образуются. 5) В системе in vitro гипертермическое воздействие 42,50С подавляет пролиферацию и усиливает апоптоз лимфоцитов в большей степени, чем клеток опухоли В16. Это означает, что супрессорное влияние гипертермии в первую очередь будет затрагивать пролиферативные лимфоидные реакции и объясняет отсутствие эффекта гипертермии как в качестве моновоздействия, так и в сочетании с вакцинотерапией в условиях in vivo. СПИСОК СТАТЕЙ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Селедцова Г.В., Стрункин Д.Н., Самарин Д.М., Сенюков В.В., Кащенко Э.А. Ксеновакцинотерапия в лечении онкозаболеваний. // Материалы 5-й отчетной сессии ИКИ СО РАМН-2000.-С.118-119. Фельде М.А., Селедцов В.И., Самарин Д.М., Повещенко О.В., Кащенко Э.А., Шишков А.А., Козлов В.А. Иммунологические показатели при ксеновакцинотерапии меланомы // Russian Journal of Immunology. Тезисы Объединенного иммунологического форума, Екатеринбург 2004.- С.335. Шишков А.А., Фельде М.А., Селедцов В.И., Самарин Д М., Кащенко Э.А., Козлов В.А. Выживаемость больных меланомой кожи IV клинической группы при использовании в лечении ксеновакцинотерапии // Материалы Российской научно-практической конференции Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии. Томск 2004.-С.75. Кащенко Э.А., Селедцов В.И., Ширинская А В., Селедцова Г.В., Самарин Д.М., Повещенко О.В., Фельде М.А., Пронкина Н.В. Изменение соотношения фаз клеточного цикла и пролиферативной активности спленоцитов и опухолевых клеток в результате воздействия физиотерапевтических факторов // Материалы Всероссийской научно-практической конференции « Дни иммунологии в Сибири». Красноярск 2005.-С.78-80 . Селедцов В.И., Фельде М.А., Самарин Д.М., Селедцова Г.В., Шишков А.А., Ницца Н.А., Тюримин Я.Л., Кащенко Э.А., Повещенко О.В. Ксеновакцинотерапия в лечении меланомы // Материалы Всероссийского научного симпозиума «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет». Цитокины и воспаление.-2005.-Т.4.-№2.-С.112. Фельде М.А., Самарин Д.М., Ницца Н.А., Шишков А.А., Повещенко О.В., Кащенко Э.А., Селедцов В.И., Селедцова Г.В., Козлов В.А. Оценка клеточной иммунореактивности при ксеновакцинотерапии пациентов IV стадией колоректального рака // Клиническая иммунология.-2006.-№1.-С.43-48. Кащенко Э.А., Селедцов В.И., Самарин Д.М., Селедцова Г.В., Повещенко О.В., Суровцева М.А. Эффекты физиотерапевтических воздействий на пролиферацию, клеточный цикл и уровень апоптоза опухолевых клеток и нормальных лимфоцитов //Материалы VII отчетной конференции ГУ НИИ КИ СО РАМН. Новосибирск.-2006.-С. 101-102. Суровцева М.А., Ницца Н.А., Самарин Д.М., Шишков А.А., Повещенко О.В., Кащенко Э.А., Селедцов В.И., Селедцова Г.В. Ксеновакцинация в лечении колоректального рака //Материалы VII отчетной конференции ГУ НИИ КИ СО РАМН. Новосибирск.-2006.-С. 281-285. Кащенко Э. А., Самарин Д. М., Селедцова Г. В., Шишков А.А., Повещенко О.В. Исследование эффективности применения специфической и неспецифическй иммунотерапии у мышей-опухоленосителей при гипертермическом воздействии // Медицинская иммунология.-2007.-Т.9.-С.143-144. Селедцов В.И., Фельде М.А., Самарин Д.М., Селедцова Г.В., Шишков А.А., Ницца Н.А., Тюрюмин Я.Л., Кащенко Э.А., Повещенко О.В., Козлов В.А. Иммунологические и клинические аспекты применения ксеновакцинотерапии в лечении меланомы // Российский онкологический журнал. 2006; № 4: 23-29. Белогородцев С.Н., Кащенко Э.А., Шишков А.А., Майбородин И.В., Селедцова Г.В. Ауто-и ксеновакцинотерапия у мышей-опухоленосителей меланомы В16 // Сибирский медицинский журнал. Материалы научной конференции с международным участием. «Дни иммунологии в Сибири-2008».-2008; № 3.-Т. 23.-С.84. Кащенко Э.А., Белогородцев С.Н., Селедцова Г.В., Самарин Д.М., Майбородин И.В., Селедцов В.И., Шишков А.А., Савкин И.В., Козлов В.А. Ксеновакцинотерапия меланомы в эксперименте // Сибирский онкологический журнал. 2009.-№1 (31).-С.28-31. Кащенко, Э.А., Белогородцев С.Н., Селедцова Г.В., Самарин Д.М., Майбородин И.В., Селедцов В.И., Шишков А.А., Савкин И.В., Козлов В.А. Направленность иммунного ответа при вакцинотерапии в эксперименте // Вестник уральской медицинской академической науки. 2009.- №2/1 (24).-С.313-315.

Похожие:

	Содержание ...		Джон Колеман Комитет 300. Тайны мирового правительства Бывшие и ныне действующие учреждения и организации комитета 300, а также те, которые находятся под непосредственным его влиянием
	Джон Колеман Комитет 300. Тайны мирового правительства Бывшие и ныне действующие учреждения и организации комитета 300, а также те, которые находятся под непосредственным его влиянием		Основы физической культуры Физическая культура Физическая культура воздействует на жизненно важные стороны индивида, полученные в виде задатков, которые передаются генетически...
	Инструкция к заданиям первого, практического тура Продолжительность жизни хвои у сосны составляет 3-4 года; за это время она накапливает такое количество сернистого газа, которое...		1Требования к средствам индивидуальной защиты органа слуха Высокий уровень шума на производстве – вредный производственный фактор. Под его влиянием нарушается сложная регулирующая функция...
	Данный метод может применяться для измерения концентраций свободного... Т4 не имеет собственной активности, а служит только в качестве прогормона для Т3 Циркулирующие уровни Т3 находятся под влиянием изменений...		Санитарно-эпидемиологические правила сп 3 3332-16 Илп, предназначенных для иммунопрофилактики, иммунотерапии и диагностики болезней и аллергических состояний, при их транспортировании...
	На процесс формирования когнитивных карт пространства Оценка искажений пространственных представлений проводилась при помощи метода отображения и анализа карт-обзоров пространства. Результаты...		Конвенция о безопасности и гигиене труда и производственной сфере (Конвенция 155) Работодатели должны обеспечивать, насколько это обоснованно и практически осуществимо, чтобы находящиеся под их контролем рабочие...
	Американские врачи солидарны с отечественными в том, что тамифлю... Да и врачи из фирмы-производителя также не сомневаются в этом. Подобная статистика привела к тому, что в Стране Восходящего Солнца...		Ильин В. А. И 49 Археология детства: Психологические механизмы семейной жизни И 49 Археология детства: Психологические механизмы семейной жизни — М.: Независимая фирма “Класс”, 2002. — 208 с. — (Библиотека психологии...
	Настройка телевизионных приёмников некоторых моделей и dvb-c приставки... Настраиваем параметры "Частота начала 474000", "Частота окончания 498000", "Модуляция 128qam" и "Скорость передачи 6975"		Список частот цифрового вещания: Частота: 770 mhz Модуляция: 256qam... Для настройки встроенного dvb-c тюнера для приема программ цифрового кабельного телевидения необходимо использовать следующие параметры...
	Диссертация на тему: Организационно-педагогические механизмы формирования... На тему: «Организационно-педагогические механизмы формирования многоуровневой модели непрерывного профессионального образования в...		Инструкция по технике безопасности перед началом работы необходимо... Ется использовать инструмент со снятой крышкой или отвернутыми винтами ее крепления. Если крышка и винты были предварительно демонтированы,...