Традиционные методы получения моноклональных антител
|
Скачать 0.73 Mb.
|
    Главы из книги «Введение в молекулярную иммунологию и гибридомную технологию», автор: ведущий сотрудник лаборатории биотехнологии ВНЦМДЛ кандидат биологических наук Солопова Ольга Николаевна. Традиционные методы получения моноклональных антител. 1.Общие свойства моноклональных антител. Моноклональные антитела (монАТ), в отличие от поликлональных, являются продуктом секреции одной антитело- продуцирующей клетки, либо ее потомков (клона), образовавшихся в процессе деления этой клетки. Все монАТ, являющиеся продуктом одного клона, представлены идентичными молекулами, отсюда вытекают основные свойства моноклональных антител: а) Все молекулы монАТ, являющиеся продуктом одного клона, имеют одинаковую специфичность, то есть, направлены против одинаковых мест связывания (антигенных детерминант) на каком-либо конкретном антигене, тогда как поликлональная сыворотка имеет в своем составе антитела к разным участкам связывания с антигенам и даже к разным антигенам. б) Все молекулы монАТ, являющиеся продуктом одного клона, имеют одинаковое сродство к связываемому антигену (аффинность), то есть моноклональные антитела бывают высокоаффинными («прочно» связывающие антиген) и низкоаффинные (образующие легко диссоциирующий комплекс с антигеном). Поликлональная сыворотка всегда представлена антителами разной аффинности. в) Все молекулы монАТ, являющиеся продуктом одного клона, имеют один изотип и субизотип иммуноглобулинов, чего нельзя сказать о поликлональной сыворотке. 2. Применение моноклональных антител. Все вышеперечисленные свойства монАТ дают им преимущества перед поликлональными сыворотками в использовании их в диагностических целях, где монАТ нашли свое самое широкое применение. 2.1.Клиническая диагностика растворимых антигенов. Почти все известные схемы анализа растворимых антигенов на основе монАТ можно отнести к двум типам: метод «двойного сэндвича» (рис.1.) и конкурентный анализ (рис.2.). В обоих случаях используют твердофазный носитель, на который прикрепляют (сорбируют) тем или иным способом монАТ. Далее, в случае «двойного сэндвича», этот носитель инкубируют с исследуемым раствором (чаще всего это биологические жидкости, которые хотят проверить на содержание в них какого-либо белка или низкомолекулярного соединения). Во время инкубации этот антиген (если он имеется в исследуемом растворе) связывается с монАТ, все несвязавшиеся компоненты образца удаляют, промывая твердый носитель буферными растворами или водой. Затем инкубируют со «вторыми» моноклональными антителами, которые, во-первых, должны быть направлены к другой части молекулы антигена, не экранированной первыми сорбированными монАТ, а, во-вторых, должны иметь на себе какую-либо метку, позволяющую регистрировать наличие или отсутствие присоединения «вторых» монАТ к твердому носителю и делать выводы о наличии и количественном содержании искомого антигена в растворе. Недостатком этого метода является необходимость иметь два монАТ, направленных к разным участкам молекулы антигена и не мешающих друг другу связываться с антигеном. Существует ряд антигенов, как правило, низкомолекулярных, для которых невозможно получить такую пару монАТ по той причине, что антиген имеет только одну антигенную детерминанту, либо антигенные детерминанты расположены на недостаточном расстоянии друг от друга для того, чтобы две достаточно крупные молекулы антител могли независимо их связывать. В таких случаях используют в среднем менее чувствительный конкурентный анализ. Для этого на твердофазный носитель прикрепляютмонАТ, затем инкубируют его с исследуемым образцом, куда предварительно добавили меченый антиген, который хотят обнаружить в образце. При наличии в образце искомого антигена (естественно, немеченого) последний препятствует связыванию меченого антигена ссорбированными монАТ (конкурирует с ним за связывание с монАТ). В результате самый сильный сигнал наблюдают при отсутствии в исследуемом растворе искомого антигена (отрицательный контроль), а о содержании антигена можно судить по уровню снижения сигнала по сравнению с отрицательным контролем. 2.2.Диагностика вирусов, бактерий и паразитов. Для диагностики вирусов, бактерий и паразитов чаще применяют вышеописанный метод «двойного сэндвича». Все эти антигены относятся к крупным надмолекулярным образованиям, поэтому стерических проблем со связыванием антител не бывает, даже если и «первые», сорбированные, и «вторые» меченые монАТ направлены к одной и той же антигенной дереминанте, так как каждая антигенная детерминанта многократно повторена на целой клетке или вирусной частице. Существуют некоторые особенности диагностики вирусов, бактерий и паразитов: а) Многие из них могут представлять опасность для окружающей среды и людей, проводящих анализ, поэтому исследуемые образцы предварительно подвергают обработке, уменьшающую их возможную инфекционность. б) Некоторые микроорганизмы представлены разными штаммами и линиями, среди которых могут быть и патогенные, и непатогенные (например, кишечная палочка Е.coli). Для диагностики конкретных патогенных штаммов необходимо использовать такие монАТ, которые избирательно связывают только искомые линии и штаммы. В этом случае применение моноклональных антител имеет особенную ценность, поскольку набор поверхностных антигенных детерминант у разных штаммов и линий микроорганизмов одного вида очень похож, и поликлональная сыворотка не в состоянии «отличать» патогенные штаммы одного вида от непатогенных. в) Все грамотрицательные бактерии имеют на своей поверхности «шубу», состоящую из липополисахаридов (ЛПС) и предохраняющую бактериальную клетку от взаимодействия антител с бактериальными мембранными белками. Антитела против ЛПС являются не лучшими с точки зрения диагностики микроорганизмов, поскольку молекулы ЛПС очень похожи по структуре и даже часто идентичны не только у разных штаммов одного вида , но и у бактерий разных видов. В связи с этим для диагностики грамотрицательных бактерий необходимы монАТ со следующими свойствами: во-первых, они должны быть направлены против поверхностных бактериальных белков, а не ЛПС; во-вторых, избирательно связывать только искомые штаммы бактерий. Кроме того, иногда необходима предварительная обработка образца для того, чтобы удалить ЛПС и экспонировать белковые антигенные детерминанты. 2.3. Диагностика поверхностных антигенов эукариотических клеток, в частности CD антигенов. В настоящее время только CD антигенов известно порядка сотни, кроме них на поверхности клеток имеются молекулы адгезии и разнообразные рецепторы. Качественный и количественный состав поверхностных антигенов может дать ценную информацию о функциях конкретной клетки, о ее принадлежности к опухолевым или вирус- инфицированным. Исследование поверхностных молекул клеток позволяет диагностировать ряд заболеваний человека или животного. И вновь моноклональные антитела оказываются незаменимыми в такой диагностике, так как направлены против конкретных поверхностных антигенов. 2.4. Персональные диагностические наборы. Наиболее широко сейчас используются персональные наборы для определения беременности в домашних условиях. В их основе лежит цветная реакция взаимодействия хорионического гонадотропина мочи с соответствующими моноклональными антителами. Несомненно, большую перспективу могли бы иметь подобные наборы для ранней диагностики опухолевых и инфекционных заболеваний, для определения нежелательных примесей в воде, пищевых продуктах, лекарствах и парфюмерных товарах. 2.5. Использование моноклональных антител в препаративных целях. С развитием методов генной инженерии особенно остро встал вопрос о необходимости наладить выделение генноинженерных продуктов из их источников (бактериальных и дрожжевых клеток и др.). Часто генноинженерные (или их еще называют рекомбинантные) белки используются в качестве компонентов фармакологических препаратов, производимых в промышленных масштабах, поэтому предъявляются особые требования к их чистоте и к стоимости их очистки . В этом случае выделение белков и пептидов с помощью моноклональных антител практически не имеет конкурентов, так как может производиться в один этап и с высокой степенью очистки. Наиболее распространенным методом выделения белков с использованием моноклональных антител стала аффинная хроматография. Основной ее принцип заключается в следующем: На полимерные гранулы (например, сефароза), называемые иначе сорбентом, химически пришивают молекулы моноклональных антител, и эти гранулы помещают в хроматографические колонки. Далее через эти колонки пропускают растворы (экстракты), из которых хотят выделить нужное вещество, при этом используют такие условия (величина ионной силы раствора, рН, температура и др.), когда с монАТ связываются только требуемые компоненты раствора, а все остальные вымываются. После тщательной промывки колонки от несвязавшихся веществ производят элюцию (смыв) тех веществ, которые специфически связались с монАТ на сорбенте, используя для этого предварительно подобранные условия элюции (изменяют рН раствора, ионную силу и др.). В результате относительно несложной процедуры получают практически чистый препарат белка или пептида. Примерно такой же подход применяют и в исследовательских целях, когда хотят обогатить образец конкретным веществом для последующего его использования в других методиках. 2.6. Применение моноклональных антител в терапии. По сравнению с диагностикой и препаративным выделением, моноклональные антитела пока не очень широко используются для лечения заболеваний, и этому есть целый ряд причин: а) бактериальные инфекции удобней лечить с помощью таких более доступных средств, как антибиотиков или солевых растворов (как, например, при лечении холеры); б) вирусы, являясь внутриклеточными паразитами, плохо доступны для моноклональных антител. Пожалуй, наиболее перспективным направлением для использования моноклональных антител в терапии- это нейтрализация токсинов и терапия опухолей, где антитела против опухоле-ассоциированных антигенов пытаются использовать в целенаправленной транспортировке лекарственных средств к раковым клеткам. В последнее время появились сообщения о получении человеческих монАТ, избирательно вызывающих апоптоз опухолевых клеток, и не действующих на здоровые. Помимо этого ведутся работы по разработке вакцин на основе моноклональных антител. Теоретическая основа существования таких вакцин основана на концепции антиидиотипических антител «внутреннего образа»: если моноклональные антитела направлены против антиген- связывающего участка других моноклональных антител, они иногда копируют участок антигена, то есть несут «внутренний образ» этого антигена и способны вызывать антиген-специфический иммунный ответ. (Рис. 3). Именно такие антитела или их Fv-фрагменты и предложено использовать в составе вакцин вместо антигена. Еще одним возможным аспектом применения моноклональных антител в терапии является использование антител, обладающих самостоятельной ферментативной активностью, либо способных влиять на активность различных ферментов. Механизм действия таких антител (иначе их называют абзимы) заключается в том, что а) антитело может быть направлено к активному участку фермента и мешать (помогать) осуществлению ферментом своей функции; б) антитело может быть направлено против молекулы субстрата или к переходному от субстрата к продукту соединению и таким образом может понижать (или повышать) энергетический барьер превращения субстрата в продукт (то есть фактически самостоятельно выполнять функции фермента). Основные проблемы, возникающие при использовании монАТ в терапии: а) Подавляющее большинство получаемых монАТ имеет животное происхождение (мышиные или крысиные), в результате чего иммунная система человека воспринимает их как чужеродный белок и быстро разрушает. МонАТ при этом не успевают проявить свое лекарственное действие. б) Некоторые монАТ нечеловеческого происхождения могут связывать и выводить из строя жизненно важные молекулы в организме человека, иногда это может привести к летальному исходу (например, агглютинация (склеивание) клеток крови под воздействием антител против поверхностных антигенов). в) Мышиные и крысиные монАТ являются для человека сильным иммуногеном, и введение их в терапевтических дозах может вызывать аллергические реакции вплоть до анафилактического шока. Во избежание всех этих неприятностей необходимо использовать для лечения антитела не животного, а человеческого происхождения. Масштаб использования моноклональных антител в современном мире таков, что, если бы создатели технологии по получению монАТ запатентовали свое открытие, то суммарный патентный сбор превысил бы годовой бюджет всей Великобритании. 3.Основные этапы получения моноклональных антител методом гибридомной технологии. Долгое время единственным источником монАТ были опухолевые линии антитело- продуцирующих клеток миеломы и плазмацитомы, выделенные из больных людей и животных. Такие клетки могли быть адаптированы к росту в культуральных средах и секретировать моноклональные антитела, но было очень трудно и зачастую даже невозможно определить антиген, к которому эти антитела были направлены. Понятно, что использование таких монАТ было очень ограничено. Ситуация кардинально изменилась в 1975 году, когда ученые Kohler иMilshtein предложили метод получения моноклональных антител предопределенной специфичности, за что позднее были удостоены Нобелевской премии. Смысл гибридомной технологии заключается в создании гибридной клетки (получившей название «гибридома»), получаемой путем слияния антитело- продуцирующего В-лимфоцита и опухолевой клетки миеломного или плазмацитомного ряда. (Рис.4). Такая гибридома обладает свойством секретировать антитела, взятой у В-лимфоцита, и способностью к бесконечному делению, взятой у опухолевой клетки. Источником В-лимфоцитов для получения гибридомы служат лимфоидные органы животного, гипериммунизированного тем антигеном, против которого хотят получить монАТ. Гипериммунизация сильно повышает процентное содержание В-лимфоцитов, продуцирующих антитела желаемой специфичности, в общей популяции клеток лимфоидного органа. Лимфоциты, выделенные из тканей селезенки,лимфоузлов, периферической крови, не способны к самостоятельному делению и живут в культуре всего 10-14 дней. Миеломные клетки, напротив, могут жить и делиться в культуре сколь угодно долго, но не продуцируют антитела нужной специфичности (чаще используют линии миелом или плазмацитом, вообще не продуцирующие никаких антител). В результате процедуры гибридизации (слияния) образуется гетерогенная популяция клеток, состоящая, во-первых, из неслившихсяклеток лимфоидного органа; во-вторых, из неслившихся клеток миеломы; в-третьих, из гибридов лимфоцит+лимфоцит и миелома+миелома; в четвертых, из гибридов лимфоцит+миелома, из которых лишь часть (часто весьма небольшая) стабильно продуцирует антитела нужной специфичности. Понятно, что необходимо отделить интересующие клетки от всех остальных. От неслившихся лимфоцитов и гибридовлимфоцит+лимфоцит избавляться не нужно: через несколько дней они умрут сами; от неслившихся опухолевых клеток и гибридов миелома+миелома избавляются с помощью селективных сред (подробности ниже); среди оставшихся клеток (гибридов лимфоцит+миелома) отбирают нужные путем клонирования, когда из одной клетки выращивают популяцию клеток (клеточный клон) и отбирают среди таких клонов лишь те, которые стабильно продуцируют антитела требуемой специфичности. Секрецию антител определяют различными методами скрининга супернатантов гибридом, другими словами, проводят анализ тойкультуральной среды, в которой рос конкретный клон. При наличии в супернатанте желаемых антител проводят еще одно или несколькоклонирований, затем клетки нарабатывают для получения большего количества антител либо в культуре, либо в перитонеальной полости мышей (крыс). Далее антитела выделяют из культуральной или асцитной жидкости и проводят более детальные исследования на предмет их пригодности для использования в тех целях, для которых монАТ были получены. Клетки–продуценты можно заморозить и хранить в жидком азоте долгое время. Рассмотрим теперь подробнее каждый из этапов получения монАТ: |
Похожие:
 |
Торговое Стелара (Stelara) Относится к классу моноклональных человеческих антител, ингибирующих действие воспалительных цитокинов путем связывания одного из... |
 |
В настоящее время для лечения заболеваний кожи и волос все шире используют... Рефлексотерапия включает традиционные восточные методы лечения (иглотерапию, прижигание-прогревание акупунктурных точек полынными... |
|
Галогенирование Для реакций получения галогенсодержащих соединений приведены основные механизмы реакций и представлены методы синтеза. С целью идентификации... |
|
Методы исследования в природе с учащимися Для этих целей используются как традиционные средства полевых исследований (бинокль, видеокамеры), так и сложное лабораторное оборудование... |
|
Антонович К. М. Использование спутниковых радионавигационных систем в геодезии (том 2) Тема Введение. Государственная геодезическая сеть (ггс) назначение, требуемая точность построения и плотность пунктов. Традиционные... |
|
Лекция №9 Суспензии. Определение. Характеристика. Назначение. Методы... Аппаратура: ультразвуковые генераторы, фрикционные и коллоидные мельницы, рпа и др. Особенности получения суспензий дисперсионным... |
|
SpermMar Test IgG Асат класса IgG. Тем не менее, спермальные антитела класса IgA редко существуют без антител класса IgG. Поэтому тестирование спермальных... |
|
Учебное пособие. М.: Издательство "Март", 2004. Предыдущая Моделирование как метод теории принятия решений и анализ ряда конкретных моделей предмет четвертой части. Приводятся методы принятия... |
|
Качественный латексный тест для определения спермальных антител.... Прямой тест может выполняться на необработанном человеческом семени, содержащем подвижные сперматозоиды, в непрямом тесте можно использовать... |
|
Общая сравнительная характеристика традиционной и минимальной технологий... Азности использования для ресурсосберегающего земледелия техники, поддерживающей технологии «лидер», приведена сравнительная характеристика... |
|
Тест-системы для определения антиядерных антител и антител к возбудителям... «Поставщик», в лице заместителя директора Апуневич Марины Ивановны, действующей на основании доверенности №07/06/13-1 от 17 июня... |
|
1. Сбор, сушка и хранение и переработка лрс Понятие о терпеноидах, классификация. Биогенез (теории Ружички, Линена-Блоха по вопросам происхождения терпенов). Локализация эфирных... |
|
R14100210 Способ получения антитела, специфически связывающего домен... Изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии и медицине и может быть использовано для создания растений – суперпродуцентов... |
|
Тема современные методы системных исследований Основные направления социологических исследований. Методы, используемые в рамках социологических исследований. Методологическая стратегия... |
|
Проекта Создание технологической платформы для производства однодоменных терапевтических антител |
|
Всероссийские традиционные соренования по лыжным гонкам среди юношей... |