1.1.Основные ферменты микроорганизмов. Их роль в обмене в-в
Ферменты — биологические катализаторы высокомолекулярной структуры, вырабатываемые живой клеткой. Они имеют белковую природу, строго специфичны и играют важнейшую роль в обмене веществ микроорганизмов. Специфичность их связана с активными центрами, образуемыми группой аминокислот. Ферменты позволяют некоторым микроорганизмам усваивать метан, бутан, другие углеводороды и синтезировать из них сложные органические соединения. Биохимические признаки. Для определения способности микроорганизмов ферментировать углеводы (сахаролитические свойства) используют короткий и длинный «пестрый» ряд. К первому относятся жидкие среды Гисса с моно- и дисахаридами: глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и с шестиатомным спиртом — маннитом. В длинный «пестрый» ряд наряду с перечисленными углеводами вводят среды с разнообразными моносахаридами (арабиноза, ксилоза, рамноза, галактоза и др.), полисахаридами (инулин, крахмал, гликоген и др.) и спиртами (глицерин, дульцит, инозит и др.). В качестве индикатора ко всем средам добавляют реактив Андреде или ВР.
Чистую культуру исследуемого микроба засевают петлей в среды «пестрого» ряда. Посевы инкубируют при 37°С в течение 18—24 ч или более длительно. В том случае, если бактерии ферментируют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды; при разложении углевода до кислоты и газообразных продуктов наряду с изменением цвета появляется пузырек газа в поплавке. Если используются среды с полужидким агаром, то образование газа регистрируется по разрыву столбика. При отсутствии ферментации цвет среды не меняется. Поскольку бактерии ферментируют не все, а только определенные для каждого вида углеводы, входящие в состав сред Гисса, наблюдается довольно пестрая картина, поэтому набор сред с углеводами и цветным индикатором называют «пестрым» рядом. Обнаружение каталазы. Напредметное стекло аносят каплю1—3% раствора перекиси водорода и вносят нее петлю с бактериальной культурой. Выделение пузырьков кислорода свидетельствует о наличии у данного вида бактерий фермента каталазы.
|
1.2.Требования к питательным средам
В лабораторных условиях бактерии выращивают на питательных средах. Большое значение для роста и размножения бактерий имеют температурные условия. Все микроорганизмы по отношению к температурному режиму подразделяются на три группы: психрофильные (холодолюбивые), мезофильные (средние), термофильные (теплолюбивые) Бактерии могут размножаться в широком диапазоне температур—от 0°С до +90°С.
Для жизнедеятельности бактерий большое значение имеет рН среды. Каждый вид микроба в процессе эволюции приспособился для существования в определенных границах рН, за пределами которых жизнедеятельность его невозможна.
Предполагают, что рН влияет на активность ферментов. В зависимости от рН слабые кислоты в кислой среде находятся в виде молекул, а в щелочной—в виде ионов. Сапрофиты могут жить в условиях с чрезвычайно широким диапазоном рН — от 2 до 8,5. Патогенные же виды микробов растут при рН 6—8 (табл. 6).
Питательные среды должны быть легкоусвояемыми, с известным составом азотистых и углеводных веществ, витаминов, необходимой концентрацией солей, изотоничные, стерильные, обладать буферными свойствами, иметь оптимальную вязкость и определенный окислительно-восстановительный потенциал. определенные аминокислоты, витамины и другие вещества.
По консистенции питательные среды бывают плотные (мясо-пептонный агар, мясо-пептонный желатин, свернутая сыворотка, картофель, свернутый яичный белок), полужидкие (мясо-пептонный агар) и жидкие (пептонная -вода, мясо-пептонный бульон, сахарный бульон и др.).
Питательные среды должны содержать необходимые для питания микробов питательные вещества.
Иметь реакцию рН, оптимальную для выращиваемого вида микроба.
Питательные среды должны иметь достаточную влажность и вязкость, т.к. микробы питаются по законам диффузии и осмоса. Обладать изотоничностью и иметь определенный окислительно-восстановительный потенциал (гН2).
Питательные среды должны быть стерильными, обеспечивая тем самым возможность выращивания чистых культур.
Потребность в питательных веществах и физических условиях у различных видов микробов неодинакова, и этим исключается возможность создания универсальной питательной среды.
По консистенции различают плотные и жидкие питательные среды. Плотные готовят на основе жидких посредством прибавления к ним клеевых веществ: агар-агара или желатина! Агар-агар (по-малайски - желе) - продукт растительного происхождения, добывается из морских водорослей. В воде агар-агар растворяется при температуре 80-86°С, затвердевает при 36-40, и поэтому используется для уплотнения питательных сред для выращивания разных групп микроорганизмов при оптимальной для них температуре.
|
1.3.Санитарно-микробиологическое исследование воздуха
Основная задача санитарно-микробиологического исследования воздуха — гигиеническая и эпидемиологическая оценка воздушной среды, а также разработка комплекса мероприятий, направленных на профилактику аэрогенной передачи возбудителей инфекционных болезней. При оценке санитарного состояния закрытых помещений в зависимости от задач исследования определяют ОМЧ, наличие СПМ (стафилококков, а- и бета-гемолитических стрептококков, являющихся показателями контаминации микрофлорой носоглотки человека). В связи с развитием биотехнологической промышленности, использующей различные микроорганизмы-продуценты БАВ, существенно возрос риск выброса в атмосферу больших концентраций микробов, в том числе с изменённым генотипом. При этом, технология производства некоторых веществ прямо включает периодический выпуск микроорганизмов. Указанное придаёт проблеме контроля за микрофлорой атмосферного воздуха и обеззараживания выбросов биотехнологических предприятий особую актуальность.
Микробная загрязнённость воздуха имеет непостоянный и локальный характер, то есть микрофлора воздуха зависит от места и времени отбора проб. Летом обсеменённость воздуха в несколько раз выше, чем зимой. Особенно насыщен атмосферный воздух микроорганизмами над крупными городами. При рассмотрении качественного состава микрофлоры воздуха следует различать микрофлору атмосферного воздуха и воздуха жилых помещений.
Микрофлора атмосферного воздуха. В атмосферном воздухе СПМ (стафилококки и стрептококки) обнаруживают лишь в 3,7% проб, взятых в местах большого скопления людей. Среди микроорганизмов доминируют виды, обитающие в почве. В атмосферном воздухе в основном встречают три группы микроорганизмов.
• Пигментообразующие кокки в солнечные дни составляют до 70-80% всей флоры (пигмент защищает бактерии от инсоляции).
•Почвенные споровые и гнилостные микроорганизмы. Их содержание резко увеличивается в сухую и ветреную погоду.
• Плесневые грибы и дрожжи. Их содержание увеличивается при повышении влажности воздуха.
В отличие от воздуха закрытых помещений, в атмосферном воздухе постоянно происходят процессы самоочищения. Этот процесс происходит благодаря осадкам, инсоляции, температурным воздействиям и другим факторам. В свою очередь атмосферный воздух сам по себе — фактор очищения воздуха жилых помещений.
Микрофлора воздуха закрытых помещений более однообразна и относительно стабильна. Среди микроорганизмов доминируют обитатели носоглотки человека, в том числе патогенные виды, попадающие в воздух при кашле, чихании или разговоре. Основной источник загрязнения воздуха патогенными видами — бактерионосители. Уровень микробного загрязнения зависит главным образом от плотности заселения, активности движения людей, санитарного состояния помещения, в том числе пылевой загрязнённости, вентиляции, частоты проветривания, способа уборки, степени освещённости и других условий. Так, регулярные проветривания и влажная уборка помещений снижает обсеменённость воздуха в 30 раз (по сравнению с контрольными помещениями). Самоочищения воздуха закрытых помещений не происходит.
|
2.1.Понятие систематитки мк-ов
Систематика (таксономия) бактерий является не только одним из наиболее важных и сложных, но и менее разработанных разделов микробиологии. Задачами систематики являются: классификация, номенклатура и идентификация организмов. Классификация – распределение множества организмов по группам (таксонам). Номенклатура – присвоение названия отдельным группам и микроорганизмам. В систематике бактерий, также как в ботанике и зоологии, принята бинарная номенклатура, согласно которой бактериям присваивается название, состоящее из двух слов: первое определяет их принадлежность к определенному роду, второе – виду. Например, Clostridium tetani и Clostridium botulinum – два различных вида бактерий, относящихся к одному роду. Названия бактериям присваивают в соответствии с правилами Международного кодекса номенклатуры бактерий. Основной таксономической категорией является вид. Виды объединяют в роды, роды – в семейства, семейства – в порядки, далее следуют классы, отделы, царства. В микробиологии существуют также более мелкие таксономические единицы чем вид: подвид (subspeciens), разновидность. Подвиды могут различаться по физиологическим (biovar), морфологическим (morphovar), или по антигенным свойствам (serovar). Большое значение в микробиологии имеют такие понятия, как клон – чистая культура, полученная из одной клетки, и штаммы – культуры бактерий одного вида, выделенные из различных источников или из одного источника в разное время, или полученных в ходе генетических манипуляций. Разные штаммы одного и того же вида бактерий могут отличаться друг от друга по целому ряду свойств, например по чувствительности к антибиотикам, способности к синтезу токсинов, ферментов и др. Идентификация устанавливает принадлежность микроорганизмов к определенному таксону на основании наличия конкретных признаков. В большинстве случаев идентификация заключается в определении родовой и видовой принадлежности микроорганизмов. Определение бактерий до вида важно не только с позиции чисто познавательной, общебиологической, но и связано с решением ряда прикладных и научных задач. Особенно это важно для медицинской, ветеринарной и промышленной микробиологии, где действующими объектами являются микроорганизмы и мельчайшие неточности в определении вида могут привести к нежелательным последствиям.
Все микроорганизмы, существующие в биосфере Земли, относятся к трем царствам природы:
I. Эукариоты — простейшие и грибы. II. Прокариоты-цианобактерии (отдел 1) — синезеленые водоросли, получающие энергию за счет фотосинтеза, и скотобактерии (отдел 2), нейтральные к свету, дифференцирующиеся в свою очередь на три класса:1.Bacteria(включает кокки, палочки, актиномицеты, спириллы, спирохеты).2. Rickettsiae. 3. Mollicutes. III. Особое царство — Vira — составляют вирусы, среди которых выделяются паразиты микроорганизмов — фаги, возбудители заболеваний высших растений, животных и человека.
В настоящее время в микробиологии приняты два различных подхода к систематике, обусловливающих существование двух систем классификации: филогенетической (естественной) и фенотипической (искусственной). В основу филогенетической классификации положена идея создания системы прокариот, объективно отражающей родственные отношения между разными группами бактерий и историю их эволюционного развития. Фенотипическая классификация преследует, в первую очередь, практические цели, заключающиеся в том, чтобы быстрее установить принадлежность микроорганизма к определенному таксону. Наиболее четко последняя получила своё выражение в «Определителе бактерий Берджи» («Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology»), периодически издаваемом Обществом американских бактериологов с привлечением к его написанию крупных специалистов из других стран, изучающих те или иные группы бактерий. Первое издание определителя было выпущено в 1923 г. группой американских бактериологов под руководством Д.Х.Берджи; девятое издание в русском переводе вышло в 1997 г. При классификации бактерий учитывается большое количество различных свойств и признаков. Свойства и признаки, характерные для всех бактерий данной группы и не характерные для микроорганизмов других групп, называют критериями систематики. Чем больше общих признаков имеют сравниваемые организмы, тем больше и оснований для включения их в одну таксономическую группу. В связи с тем, что количество признаков, используемых для классификации микроорганизмов, значительно возросло, в конце 50-х годов ХХ в. возникла нумерическая (численная) таксономия, основанная на принципах классификации французского ботаника М.Адансона (1757). В основе нумерической таксономии лежит принцип сопоставления организмов по возможно большему количеству учитываемых признаков при допущении, что все они для систематики равноценны. Однако допущение о равнозначности всех признаков является и основным недостатком нумерической таксономии. При идентификации бактерий возможно использование генетических (молекулярно-биологических), фенотипических и серологических подходов и критериев систематики.
|
2.2.фазы развития микробной популяции в периодической культуре
При изучении процесса размножения бактерий необходимо учитывать, что бактерии всегда существуют в виде более или менее многочисленных популяций, и развитие бактериальной популяции в жидкой питательной среде в периодической культуре можно рассматривать как замкнутую систему. В этом процессе выделяют 4 фазы:
• 1-я – начальная, или лаг-фаза, или фаза задержки размножения, она характеризуется началом интенсивного роста клеток, но скорость их деления остается невысокой;
• 2-я – логарифмическая, или лог-фаза, или экспоненциальная фаза, она характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток и значительным увеличением числа клеток в популяции;
• 3-я – стационарная фаза, она наступает тогда, когда число клеток в популяции перестает увеличиваться. Это связано с тем, что наступает равновесие между числом вновь образующихся и гибнущих клеток. Число живых бактериальных клеток в популяции на единицу объема питательной среды в стационарной фазе обозначается как М-концентрация. Этот показатель является характерным признаком для каждого вида бактерий;
• 4-я – фаза отмирания (логарифмической гибели), которая характеризуется преобладанием в популяции числа погибших клеток и прогрессивным снижением числа жизнеспособных клеток популяции.
Прекращение роста численности (размножения) популяции микроорганизмов наступает в связи с истощением питательной среды и/или накоплением в ней продуктов метаболизма микробных клеток. Поэтому, удаляя продукты метаболизма и/или заменяя питательную среду, регулируя переход микробной популяции из стационарной фазы в фазу отмирания, можно создать открытую биологическую систему, стремящуюся к устранению динамического равновесия на определенном уровне развития популяции. Такой процесс выращивания микроорганизмов называется проточным культивированием (непрерывная культура). Рост в непрерывной культуре позволяет получать большие массы бактерий при проточном культивировании в специальных устройствах (хемостатах и турбидистатах) и используется при производстве вакцин, а также в биотехнологии для получения различных биологически активных веществ, продуцируемых микроорганизмами.
Для изучения метаболических процессов на протяжении цикла клеточного деления возможно также использование синхронных культур. Синхронные культуры – культуры бактерий, все члены популяции которых находятся в одной фазе цикла. Это достигается с помощью специальных методов культивирования, однако через несколько одновременных делений синхронизированная клеточная суспензия постепенно снова переходит к асинхронному делению, так что число клеток увеличивается в дальнейшем уже не ступенчато, а непрерывно.
При культивировании на плотных питательных средах бактерии образуют колонии. Это – видимое невооруженным глазом скопление бактерий одного вида, являющееся чаще всего потомством одной клетки. Колонии бактерий разных видов отличаются:
•формой, величиной, прозрачностью, цветом, высотой, характером поверхности, краев, консистенцией.
|
