Инструкция по криоконсервированию клеток крови введение для долгосрочного консервирования клеток крови (эритроцитов, тромбоцитов) разработаны методы их замораживания и хранения при ультранизких (жидкий азот и его пары) и умереннонизких (электрические холодильники на -30 град.
|
Скачать 355.53 Kb.
|
| "ИНСТРУКЦИЯ ПО КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЮ КЛЕТОК КРОВИ"(УТВ. МИНЗДРАВОМ РФ 29.05.1995) "УТВЕРЖДАЮ" Первый заместитель Министра здравоохранения РФ А.Д.ЦАРЕГОРОДЦЕВ 29.05.1995 г. "СОГЛАСОВАНО" Начальник Управления организации медицинской помощи населению А.Н.ДЕМЕНКОВ 29.05.1995 г. ИНСТРУКЦИЯ ПО КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЮ КЛЕТОК КРОВИ ВВЕДЕНИЕ Для долгосрочного консервирования клеток крови (эритроцитов, тромбоцитов) разработаны методы их замораживания и хранения при ультранизких (жидкий азот и его пары) и умереннонизких (электрические холодильники на -30 град. - -80 град.) температурах. Эти методы позволяют длительно (годами) сохранять клетки в жизнеспособном и функционально полноценном состоянии и после размораживания и специальной обработки применять их для трансфузий больным. Для криоконсервирования эритроцитов используют два метода замораживания: 1. Очень быстрое охлаждение до -196 град. С. Метод не требует применения больших концентраций криопротекторных веществ, так как при этих условиях приобретает значение скорость теплоотвода от замораживаемой смеси эритроцитов с ограждающим раствором и хранение при постоянной ультранизкой температуре. Для этого применяют алюминиевые, стальные или полимерные контейнеры соответствующей конструкции и специальное жидкоазотное холодильное оборудование. Контейнеры с замороженными эритроцитами хранят в бункерах - камерах с жидким азотом (-196 град. С) или в его парах - над жидким азотом (-135 - 150 град. С). 2. Сравнительно медленное охлаждение с применением больших концентраций (до 40%) криопротекторных веществ, в основном, глицерина. Медленное замораживание эритроцитной взвеси и хранение ее при умереннонизких температурах осуществляется в воздушной камере электрорефрижераторов, обеспечивающих соответствующие температуры (-30-80 град. С). Для криоконсервирования тромбоцитов в настоящее время разрешен для клинического применения метод их контролируемого замораживания с криоконсервантом "Тромбокриодмац" с последующим хранением в жидком азоте при -196 град. С. I. МЕТОДЫ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ УЛЬТРАНИЗКИХ ТЕМПЕРАТУРАХ (В ЖИДКОМ АЗОТЕ ПРИ -196 ГРАД. С ИЛИ ЕГО ПАРАХ ПРИ -150 ГРАД. С) 1. Метод быстрого замораживания эритроцитов с раствором ЦНИИГПК 11 4 Замораживанию для длительного хранения подвергается эритроцитная масса в смеси с ограждающим раствором. Эритроциты получают из крови, заготовленной на одном из общепринятых глюкозо - нитратных растворов. Отделенная плазма хранится в замороженном состоянии до момента трансфузии или передается для приготовления из нее препаратов. Замораживанию подвергают эритроцитную массу, хранившуюся не более 5 дней после заготовки крови от донора, предпочтительно в течение первых двух суток, так как в процессе хранения при положительных температурах снижаются показатели функциональной полноценности эритроцитов, в первую очередь, кислородтранспортной функции. Для быстрого замораживания эритроцитов, предназначенных к применению в клинике, в настоящее время рекомендуется криоконсервант ЦНИИГПК 11 , содержащий в качестве криопротектора 4 глицерин, защищающий клетки от разрушения при замораживании. 1.1.1. В условиях асептики к эритроцитной массе (путем прокола пробки бутылки или дистального конца трубки пластикатного мешка иглой системы, соединенной с сосудом, содержащим ограждающий раствор) медленно (в течение 5-8 мин) при помешивании эритроцитов добавляют раствор ЦНИИГПК 11 в соотношении 1:1. 4 1.1.2. После перемешивания смесь эритроцитов с ограждающим раствором переливают через ту же систему в алюминиевый гофрированный контейнер с двумя штуцерами, для чего на один штуцер надевают резиновую трубку длиной 4-5 см, соединяемую с системой, второй штуцер служит для выхода воздуха из контейнера. Примечание: для ускорения заполнения контейнера можно применить повышенное давление стерильного воздуха через воздухоотводящую иглу во флаконе, из которого переливается в контейнер смесь эритроцитов с раствором. 1.1.3. После заполнения контейнера взвесью эритроцитов штуцеры контейнера герметизируют путем прочного навинчивания тефлоновых колпачков. На стенку контейнера у основания штуцеров наносят номер, под которым в специальном регистрационном журнале указаны все паспортные данные крови, находящейся в этом контейнере. Взвесь эритроцитов в контейнере следует оставить на 15-20 минут при комнатной температуре для полной глицеринизации эритроцитов. Более длительная экспозиция приводит к частичному гемолизу эритроцитов. 1.1.4. Замораживание производят путем погружения контейнера с эритроцитной взвесью в предназначенную для этого ванну с жидким азотом (температура -196 град. С). Замораживание дозы в 250 мл продолжается около двух минут. Об окончании замораживания судят по прекращению выделения паров азота из трубки в крышке "ванны для замораживания". 1.1.5. После замораживания контейнер с кровью переносят в специальный жидкоазотный бункер или камеру для длительного хранения замороженных биоматериалов. 1.1.6. При необходимости оттаять эритроциты нужный контейнер вынимают из хранилища и помещают в специальную емкость с жидким азотом, которую подносят к ванне для оттаивания. Оттаивание эритроцитов производят в ванне с подогретой водой (температура +45 град. С) при автоматическом покачивании (200 качаний в минуту) контейнера с кровью в течение 25 секунд. Допускается производить оттаивание при тех же температурных условиях в водяной бане путем покачивания вручную в течение 50-60 секунд. 1.1.7. Для подготовки размороженных эритроцитов к переливанию производят их отмывание от глицерина, проникшего из ограждающего раствора внутрь клеток. Введение неотмытых эритроцитов в кровоток реципиента вызвало бы их гемолиз из-за большого осмотического градиента. Для отмывания применяют растворы с последовательно снижающейся концентрацией ингредиентов (см. Приложение 1). Отмывание эритроцитов производят с помощью серийного центрифугирования. После оттаивания размороженную взвесь эритроцитов (250 мл) из алюминиевого контейнера переводят в полимерный контейнер <*>, добавляют в соотношении 1:1 один из гипертонических растворов (250 мл), предназначенных для первого этапа отмывания, контейнер со смесью клеток герметизируют и центрифугируют при 1100 g в течение 7 минут при 4 град. С. -------------------------------- <*> Для этого используют контейнеры типа Гемакон 500 или специальные контейнеры для отмывания эритроцитов (ТУ 64-2-419-90). 1.1.8. После остановки центрифуги контейнер передают в бокс. После снятия надосадочной жидкости к эритроцитам постепенно, при постоянном их помешивании, добавляют другой отмывающий раствор, предназначенный для второго этапа отмывания, в количестве до 400 мл. Взвесь осторожно перемешивают, контейнер герметизируют. 1.1.9. Контейнер со взвесью эритроцитов центрифугируют при том же режиме в течение 5 минут. После второго центрифугирования процедуру отмывания повторяют с добавлением раствора, предназначенного для третьего этапа отмывания. Взвесь центрифугируют третий раз и супернатант удаляют. К оставшимся в полимерном контейнере отмытым эритроцитам добавляют, в соотношении 1:1 ресуспендирующий раствор ЦНИИГПК 8в (Приложение 1) и контейнер герметизируют. При необходимости получения для переливания размороженной отмытой эритроцитной массы с более высоким гематокритом количество добавляемого ресуспендирующего раствора ЦНИИГПК 8в допустимо уменьшить до соотношения 1:0,5, особенно если не предполагается длительное, в течение суток, хранение конечного продукта. 1.1.10. Отмытые ресуспендированные эритроциты хранят при 4 +/- 2 град. С и используют для переливания в течение 24 часов с момента заготовки. 1.2. Метод быстрого замораживания эритроконцентрата с ограждающим раствором ЦНИИГПК 11 5 Замораживание концентрированной массы эритроцитов позволяет помещать в стандартные алюминиевые контейнеры (емкостью 250 мл) удвоенные объемы эритроцитов и, следовательно, хранить в жидкоазотных хранилищах большие их запасы по сравнению с методом замораживания разведенной взвеси эритроцитов. Это достигается удалением перед замораживанием (по окончании глицеринизации эритроцитов) избытка ограждающего раствора. Кроме того, метод позволяет при отмывании сократить число процедур отмывания размороженных эритроцитов и уменьшить объем отмывающих растворов. 1.2.1. Для криоконсервирования эритроцитов в виде эритроконцентрата применяют ограждающий раствор ЦНИИГПК 11 - М или 5 ЦНИИГПК 11 - C (см. Приложение 1). В бутылку или полимерный 5 контейнер, содержащий эритроцитную массу, медленно (в течение 5-8 минут) при постоянном помешивании добавляют в соотношении 1:1 криоконсервант ЦНИИГПК 11 . 5 1.2.2. После перемешивания эритроцитов с криоконсервантом бутылку или полимерный контейнер герметизируют и передают на центрифугирование при 1100 g в течение 20 минут при +4 град. С. Затем надосадок отделяют от эритроцитов, оставшийся эритроконцентрат в количестве 250 мл (из двух бутылок или из одного полимерного контейнера) переливают в стандартный металлический контейнер, герметизируют, паспортизируют. 1.2.3. Контейнер с эритроконцентратом замораживают путем погружения в ванну с жидким азотом. Полное замерзание завершается за 2-2,5 минуты. Контейнеры с замороженным эритроконцентратом быстро переносят в жидкоазотное хранилище и хранят в жидком азоте (-196 град. С) или в его парах (- 150 град. С). 1.2.4. При подготовке к трансфузии оттаивание эритроконцентрата производят в ванне с водой (температура + 45 град. С) при автоматическом (200 качаний в минуту) или ручном покачивании контейнера. Оттаивание завершается при ручном покачивании за 2 минуты, при автоматическом качании - за 25-30 секунд. 1.2.5. Для деглицеринизации оттаянную эритроцитную массу переливают в полимерный контейнер <*>, в котором производят все этапы отмывания. -------------------------------- <*> типа Гемакон 500 или контейнер для отмывания эритроцитов (ТУ 64-2-219-90) Для отмывания применяют как магнитные, так и солевые растворы (п.1.1.7., Приложение 1). К 250 мл размороженного эритроконцентрата добавляют постепенно при помешивании 250-300 мл отмывающего маннитного или солевого раствора N 1, контейнер герметизируют и центрифугируют 10 минут при 1100 g в рефрижераторной центрифуге при 4 град. С. 1.2.6. Надосадочную жидкость отделяют, к оставшимся эритроцитам добавляют 300-400 мл раствора N 2 для второго этапа отмывания, центрифугируют в вышеуказанном режиме в течение 5 минут и снова отделяют надосадочную жидкость. 1.2.7. К оставшимся эритроцитам добавляют раствор N 3 для третьего этапа отмывания (300-400 мл), снова центрифугируют и снимают надосадок. При наличии в надосадке значительного гемолиза (определяемого визуально) третий этап отмывания повторяется. Всего для отмывания 250 мл размороженного эритроконцентрата, полученного из 500 мл консервированной крови, используют максимально 1000 мл отмывающих растворов при трехкратном отмывании и 1350 мл отмывающих растворов - при четырехкратном отмывании. 1.2.8. К отмытому эритроконцентрату (150-200 мл) через систему - магистраль добавляют плазмозамещающий раствор ЦНИИГПК 8в (см. 1.1.9), смесь осторожно и тщательно перемешивают. При необходимости ресуспендированную эритроцитную взвесь через систему для переливания крови фильтруют в бутылку емкостью 500 мл из-под ресуспендирующего раствора с целью удаления возможных сгустков. Бутылку со взвесью герметизируют, наклеивают этикетку и направляют на хранение или непосредственно в лечебное учреждение для трансфузии. 2. Метод медленного замораживания и хранения эритроцитов при -30 град. С Метод предназначен для криоконсервирования эритроцитов при температуре -30 град. С и предусматривает использование электрических холодильников. Замораживание осуществляют в стеклянных бутылках или полимерных контейнерах, в которых заготавливается кровь. Для криоконсервирования эритроцитов, их длительного хранения в электрохолодильниках при -30 град. С и последующего отмывания методом серийного центрифугирования применяют один из двух ограждающих растворов (ЦНИИГПК 11 55, ЦНИИГПК 11 ). 5 5 2.1. Смешивание эритроцитной массы с ограждающими растворами проводят в первичных емкостях, в которых была заготовлена консервированная кровь: бутылки вместимостью 250 мл, полимерные контейнеры на 500 мл. С раствором 11 55 эритромассу смешивают в 5 соотношении 1:1. При замораживании с криоконсервантом 11 эритроцитную массу 5 смешивают с раствором в соотношении 1:1,6. К каждым 125 мл эритромассы добавляют 200 мл раствора. 2.2. Глицеринизацию эритроцитов осуществляют в течение 10 минут при легком покачивании сосуда с кровью. После герметизации, маркировки и экспозиции при комнатной температуре в течение 15-20 минут бутылки или полимерные контейнеры помещают в специальные сетки (кассеты, бязевые мешки, коробки) и переносят для замораживания и хранения в электрохолодильники. Полимерные контейнеры с глицеринизированной эритромассой, помещенные в кассеты или картонные коробки, в камере электрохолодильника размещают в горизонтальном положении. Через сутки после замораживания при необходимости они могут быть переведены в вертикальное положение. 2.3. При замораживании эритроцитов в виде эритроконцентрата эритроциты медленно (в течение 10 мин) при постоянном помешивании соединяют с раствором 11 55 в соотношения 1:1. Взвесь 5 центрифугируют в течение 20 минут - 1100 g при +4 град. С. После удаления надосадочной жидкости и герметизации сосуда его помещают на хранение в электрохолодильник. 2.4. Оттаивание проводят в водяной бане с температурой 38-40 град. С в течение 6-10 минут до полного исчезновения льда. 2.5. Деглицеринизацию размороженных эритроцитов проводят в полимерных контейнерах вместимостью 500 мл с применением солевых или маннитно - солевых растворов. Этапы отмывания эритроцитов, замороженных с раствором 11 55 5 I этап К размороженной эритроцитной взвеси (250 мл), переведенной из емкости для замораживания в полимерный контейнер, постепенно добавляют, помешивая, вначале 100 мл 6% раствора NaCI (или 16% раствора маннита) через 2-3 минуты - 150-200 мл 2% раствора NaCI (или 5% раствора маннита). Разведенную эритроцитную взвесь центрифугируют при 1100 g в течение 10 минут. II этап После удаления надосадочной жидкости к оставшимся эритроцитам, после их осторожного перемешивания, добавляют 400-450 мл 1% раствора NaCI (или 2,5% раствора маннита). Взвесь эритроцитов центрифугируют при том же режиме, но в течение 5 минут и снова отделяют надосадочную жидкость. III этап Повторить этап II. После удаления надосадочной жидкости отмытые эритроциты ресуспендируют в растворе ЦНИИГПК 8в (см. 1.1.9). Этапы отмывания эритроцитов, замороженных с раствором 11 5 I этап К размороженной эритроцитной взвеси (325 мл), хранившейся в полимерном контейнере, добавить, постепенно помешивая, 200 мл 4% раствора NaCI (или 16% раствора маннита). Через 2-3 минуты разведенную взвесь эритроцитов центрифугируют при 1100 g в течение 10 минут. II этап После удаления надосадочной жидкости к оставшимся эритроцитам, после их перемешивания, добавляют 400-450 мл 2% раствора NaCI (или 5% раствора маннита). Взвесь центрифугируют при том же режиме в течение 5 минут и снова удаляют надосадочную жидкость. III этап Оставшиеся эритроциты разводят 400-450 мл 1% раствора NaCI, центрифугируют при том же режиме в течение 5 минут, удаляют надосадочную жидкость и ресуспендируют в растворе 8в (см. 1.1.9). 2.6. Для деглицеринизации эритроконцентрата необходимо дозу (250 мл) эритроконцентрата разделить приблизительно по 125 мл в два контейнера вместимостью 500 мл и отмывать так же, как и размороженную эритровзвесь. Если после 3-го центрифугирования удаляемый супернатант будет иметь интенсивное окрашивание, следует ввести 1-2 дополнительных этапа центрифугирования с использованием последнего отмывающего раствора (1% NaCI) в объемах 400-500 мл. Отмытые клетки ресуспендируют в растворе ЦНИИГПК 8в (см. 1.1.9). |
Похожие:
 |
Гбуз астраханской области «Областной центр крови» Понятия «свежая»... Атф – к ухудшению жизнеспособности; изменение мембраны клеток к появлению гемолиза и, наконец, приживаемость перелитых эритроцитов... |
 |
Прием (осмотр, консультация) врача-специалиста Просмотр мазка крови для анализа аномалий морфологии эритроцитов, тромбоцитов и лейкоцитов |
|
Цитотоксичность и генотоксичность антител к ДНК сывороток крови больных... Гбоу дпо «Казанская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации... |
|
Выбор метода молекулярно-биологического типирования генов системы... |
|
Отчет за 2014 год Кафедра патофизиологии Роль внутриклеточных газовых трансмиттеров в молекулярных механизмах реализации апоптоза опухолевых клеток крови |
|
Инструкция по применению компонентов крови общие положения Переливанием... ... |
|
Инструкция по применению компонентов крови общие положения Переливанием... В целях совершенствования медицинской помощи населению Российской Федерации и обеспечения качества при применении компонентов крови... |
|
Инструкция по применению компонентов крови общие положения Переливанием... В целях совершенствования медицинской помощи населению Российской Федерации и обеспечения качества при применении компонентов крови... |
|
Инструкция по применению компонентов крови общие положения Переливанием... В целях совершенствования медицинской помощи населению Российской Федерации и обеспечения качества при применении компонентов крови... |
|
Инструкция по заготовке и консервированию донорской крови (в ред... Заготовка крови от доноров осуществляется с учетом необходимости удовлетворения потребности лечебно-профилактических учреждений здравоохранения... |
|
Особенности учета донорской крови и расчетов с донорами в отделениях... Многие больницы имеют в своем составе отделения переливания крови. Существуют также специализированные станции переливания крови |
|
Особенности учета донорской крови и расчетов с донорами в отделениях... Многие больницы имеют в своем составе отделения переливания крови. Существуют также специализированные станции переливания крови |
|
Крови в учреждениях службы крови рсфср В 1988-1989 гг в службе крови рсфср зарегистрировано 3 случая осложнений после крово- и плазмодачи, закончившихся летально |
|
Иммунохроматографический экспресс-тест для обнаружения скрытой крови... В настоящее время начинают использовать иммунологические методы с улучшенной чувствительностью и специфичностью по отношению к человеческой... |
|
Гематологии и переливания крови Алгоритмы исследования антигенов эритроцитов и антиэритроцитарных антител в сложнодиагностируемых случаях |
|
Холодильники это сооружения, предназначенные для охлаждения, замораживания... В помещениях (камерах) холодильника поддерживаются постоянные довольно низкие температуры (+12 – 40°С) при большой относительной... |