ОКП
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
УТВЕРЖДАЮ
Генеральный директор
ООО «ИнтерЛабСервис»
|
И. А. Гущина __________
«____» 2011 г.
|
Инструкция по применению
Наборы реагентов для определения соматических мутаций в онкогенах для лабораторных исследований in vitro с использованием ПЦР в реальном времени на оборудовании Rotor-Gene с функцией HRM
Набор лабораторных реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)»
Соответствует требованиям национальных стандартов
и технической документации изготовителя
ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ 2
1.НАЗНАЧЕНИЕ 2
2.ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА 3
2.1 Принцип метода 3
2.2 Состав набора 7
3.АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ 8
4.МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ 8
5.ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ 9
6.АНАЛИЗИРУЕМЫЕ ОБРАЗЦЫ 10
7.ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА 10
8.РЕГИСТРАЦИЯ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ РЕАКЦИИ 26
9.УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА 41
-
НАЗНАЧЕНИЕ
Наборы реагентов для определения соматических мутаций в онкогенах для лабораторных исследований in vitro с использованием ПЦР в реальном времени на оборудовании Rotor-Gene Q серии 5plex HRM (или Rotor-Gene Q серии 6) производятся компанией QIAGEN - ведущим поставщиком инновационных технологий обработки образцов и проведения исследований.
QIAGEN устанавливает стандарты в следующих областях:
Очистка РНК, ДНК и белков
Исследование нуклеиновых кислот и белков
Исследование микроРНК и РНК-интерференции
Выявление генетических и эпигенетических факторов онкологических заболеваний
Автоматизация технологий пробоподготовки и исследований
Наборы реагентов для определения соматических мутаций в онкогенах для лабораторных исследований in vitro с использованием ПЦР в реальном времени на оборудовании Rotor-Gene с функцией HRM производства QIAGEN могут применяться в клинической лабораторной диагностике.
Наборы реагентов для определения соматических мутаций в онкогенах для лабораторных исследований in vitro с использованием ПЦР в реальном времени на оборудовании Rotor-Gene с функцией HRM предназначены для качественной оценки мутационного статуса в генах EGFR, KRAS, BRAF из ДНК человека, выделенной из зафиксированных формалином и залитых в парафин образцов опухолевой ткани.
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» предназначен для выявления соматических мутаций в кодоне V600E в гене BRAF методом ПЦР в реальном времени, используя комбинацию двух технологий – аллель специфичную ПЦР с праймерами Scorpions и обеспечивает качественную оценку мутационного статуса. Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» должен применяться обученным персоналом в специально оборудованной лаборатории с пробами ДНК, извлеченными из фиксированной формалином и залитой парафином опухолевой ткани.
-
ХАРАКТЕРИСТИКА НАБОРА
-
Принцип метода
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» использует две технологии для выявления мутаций с помощью ПЦР в реальном времени — аллель специфичную ПЦР (ARMS) и праймеры Scorpions.
Аллель специфичная ПЦР (ARMS)
Аллель-специфичная или специфичная для данной мутации амплификация достигается с помощью ARMS (Amplification Refractory Mutation System, рефракторная мутационная система амплификации). Taq ДНК-полимераза (Taq) эффективна для различения соответствий и несоответствий на 3'-конце ПЦР-праймера. Специфические последовательности, несущие мутации, селективно амплифицируются даже в пробах, где большинство последовательностей не имеют данной мутации. Когда праймер полностью соответствует, амплификация проходит в полном объеме. В случае несоответствия 3'-конца последовательности геномной ДНК, происходит лишь незначительная фоновая амплификация.
Праймеры Scorpions
Регистрация продуктов амплификации происходит с использованием праймеров Scorpions. Scorpions - это бифункциональные молекулы, содержащие ПЦР-праймер, ковалентно связанный с зондом. Флуорофор в этом зонде взаимодействует со снижающим флуоресценцию гасителем, также встроенным в зонд. В ходе ПЦР, когда зонд связывается с ампликоном, флуорофор и гаситель разделяются, что приводит к повышению флуоресценции в реакционной пробирке.
Этапы работы
Работа с набором реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» проходит в два этапа. На первом этапе выполняется контрольное измерение для определения суммарной ДНК в пробе. На втором этапе определяется наличие или отсутствие мутантной ДНК.
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» включает:
- контрольная (Ctrl) система
- мутационных система для анализа мутаций
Реакционные смесь содержат внутреннюю контрольную пробу (внутренний контроль), помеченную HEX™. Это контроли наличия ингибиторов, которые могут привести к ложноотрицательным результатам.
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» имеют оптимальное разведение. Мы не рекомендуем дальнейшее разбавление реактивов, поскольку это может привести к потере производительности. Мы не рекомендуем ставить реакции, объемом менее 25 мкл, поскольку это может повысить риск ложных отрицательных результатов.
Все реактивы в наборе реагентов для определения соматических мутаций в гене разработаны специально для данного теста. Все реактивы, поставляемые в наборе реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» предназначены для использования только в том же наборе. Для поддержания оптимальной производительности реактивы в наборе не должны замещаться.
Используйте только Taq ДНК-полимеразу (Taq), которая поставляется в наборе. Не замещайте ее Taq ДНК-полимеразой (Taq) из других наборов того же или иного типа или Taq ДНК-полимеразой (Taq) от других поставщиков.
Контрольная проба
Контрольная проба (Ctrl), помеченная FAM™, используется для определения суммарной ДНК в пробе. В контрольной пробе амплифицируется участок экзона 3 гена BRAF. Праймеры и зонд разработаны так, чтобы избежать любых известных полиморфизмов BRAF.
Мутационные анализы
Мутационная проба, помеченная FAM, содержит один зонд Scorpion плюс праймеры для различения дикой и мутантной ДНК. Мутантная ДНК выявляется ПЦР - анализом в реальном времени.
Определение исходного материала для анализа
Со всеми пробами следует обращаться как с потенциально инфекционным материалом.
Материалом для анализа должна быть геномная ДНК человека, выделенная из фиксированных формалином и залитых в парафин проб опухолей. Образцы должны транспортироваться в соответствии со стандартными требованиями работы с патологическим материалом, обеспечивающим качество образцов.
Опухолевые образцы негомогенны, срезы из одного образца опухоли могут не соответствовать срезам той же опухоли. Опухолевые пробы могут также содержать неопухолевую ткань. ДНК неопухолевой ткани не должны содержать мутации BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)».
Мы рекомендуем использовать набор для выделения ДНК из тканей QIAamp® DNA FFPE (QIAGEN, кат.№ 56404) для очистки геномной ДНК из фиксированных формалином и залитых в парафин образцов опухолей. Выделение ДНК необходимо выполнять согласно инструкции к набору реагентов QIAamp DNA FFPE:
Поместите срезы, фиксированные формалином и залитые в парафин, на покровные стекла
Соскребите избыток парафина вокруг срезов ткани, используя стерильный скальпель.
Соскребите срезы тканей в микроцентрифужные пробирки, используя свежий скальпель для каждой предназначенной для выделения пробы.
Расщепление протеиназой К должно проводиться в течение 1 часа.
Очищенную геномную ДНК растворяют в 200 мкл буфера ATE (поставляемого в наборе для тканей QIAamp DNA FFPE).
Храните очищенную геномную ДНК при 15–25°C.
Определение ДНК должно основываться на ПЦР и может отличаться от количественного определения, основанного на значениях поглощения. Смесь для дополнительной контрольной реакции (Ctrl) поставляется для определения качества и количества ДНК в пробах перед анализом с использованием набора реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)».
Все пробы в наборе реагентов для определения соматических мутаций в BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» генерируют короткие продукты ПЦР. Тем не менее, набор для ПЦР не будет работать с тяжелыми фрагментами ДНК.
Пробы в дополнение к интересующей реакции содержат внутренний контроль (см. «Анализ данных»). Если оба анализа оказались неудачными, данные следует автоматически отбросить, поскольку присутствовавшие ингибиторы могли привести к ложным отрицательным результатам. Разведение пробы может снизить действие ингибиторов, однако следует отметить, что это также разбавит ДНК.
Все экспериментальные анализы должны содержать контроли.
Внутренний контроль суммарной ДНК в пробе.
Мы настоятельно рекомендуем применение дополнительной контрольной реакционной смеси (Ctrl), поставляемой с набором набора реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» для определения суммарной ДНК в пробе. В контрольном анализе амплифицируется участок экзона 3 гена BRAF. Мы рекомендуем постановку проб только с контрольной пробой, используя положительный контроль BRAF (ПК) в качестве положительного контроля и воду, свободную от нуклеаз в качестве отрицательного контроля (ОК).
Для оптимального использования реактивов в наборе реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» пробы следует обрабатывать партиями. Если пробы тестируются индивидуально, это требует большего количества реактивов и снижает количество проб, которые можно протестировать данным набором.
Анализы в реальном времени с использованием праймеров Scorpions используют число циклов ПЦР, необходимое для выявления флуоресцентного сигнала выше фонового в качестве меры молекул-мишеней, присутствующих в начале реакции. Точка, в которой сигнал получается выше фоновой флуоресценции, называется пороговым циклом (CT).
Значения ∆CT пробы вычисляются как разница между определением мутации CT и контрольным измерением CT от той же пробы. Пробы классифицируются как положительные (наличие мутации), если они дают ∆CT меньше, чем пороговое значение ∆CT для этого анализа.
Выше этого значения проба либо может содержать процент мутантной ДНК ниже необходимого для обнаружения с помощью набора (за аналитическим пределом), либо проба отрицательна по мутациям.
Значения CT мутационных, равные 40 или выше будут считаться отрицательными или находящимися за пределами чувствительности набора.
При использовании праймеров ARMS может происходить некоторое неэффективное праймирование, давая очень запоздалый фоновый CT от ДНК, не содержащей мутации. Все значения ∆CT, рассчитанные от фоновой амплификации, будут выше пороговых значений ∆CT, и проба будет классифицироваться как отрицательная по мутациям.
Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» предназначен для использования на приборе для амплификации в реальном времени QIAGEN Rotor-Gene Q 72-луночного формата.
Наборы реагентов для определения соматических мутаций в онкогенах удобны и просты в использовании. Благодаря профессионализму разработчиков, входящие в наборы реагенты имеют гарантированное высокое качество.
В соответствии с сертифицированной по ISO Системой контроля качества QIAGEN, каждая партия наборов реагентов для определения соматических мутаций в гене BRAF «BRAF RGQ PCR Kit (24)» тестируется в соответствии с утвержденными техническими условиями для обеспечения постоянного качества продукта.
|
