Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам

Скачать 1.86 Mb.

Название	Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам
страница	7/14
Тип	Методические указания

rykovodstvo.ru > Руководство эксплуатация > Методические указания

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ... 14

Определение чувствительности микроорганизмов
со сложными питательными потребностями

Определение чувствительности микроорганизмов со сложными питательными потребностями является методически одной из наиболее трудных задач, так как в ряде случаев требует одновременного использования метода серийных разведений и ДДМ, особой тщательности в выполнении всех процедур, начиная от приготовления питательных сред и инокулюма и заканчивая проведением контроля качества. В то же время эффективность эмпирической антибактериальной терапии многих инфекций, вызываемых микроорганизмами этой группы, хорошо предсказуема. Учитывая эти факты, при оценке необходимости определения чувствительности микроорганизмов этой группы к АБП необходимо объективно оценить соотношение стоимости и эффективности (клинической значимости) таких исследований, а также сопоставить стоимость полноценного материально-технического оснащения с доступными ресурсами.

Попытки даже незначительной модификации стандартных методов (замена дорогостоящих реагентов на более дешевые) могут привести к получению ошибочных, недостоверных результатов, способных ввести в заблуждение и микробиологов, и клиницистов.

Определение чувствительности Streptococcus spp.

Питательные среды

Для определения чувствительности стрептококков используют следующие питательные среды:

Для методов серийных разведений в бульоне необходимо использовать бульон Мюллера-Хинтон с добавлением 2,0 – 5,0 % лизированной лошадиной крови. Кровь лизируют замораживанием-оттаиванием с последующим центрифугированием для освобождения от теней эритроцитов.
Для методов серийных разведений в агаре и ДДМ используют агар Мюллера-Хинтон с добавлением 5 % дефибринированной бараньей крови.

Указанные добавки асептически вносят в питательную основу после автоклавирования и охлаждения до 48 – 50 ⁰С.

Определение чувствительности Streptococcus pneumoniae

Бета-лактамные антибиотики (в частности пенициллин) являются препаратами выбора для терапии пневмококковых инфекций. В то же время критерии интерпретации результатов определения чувствительности пневмококков к этим препаратам постоянно пересматриваются в связи с появлением новых клинических и экспериментальных данных об эффективности различных бета-лактамов при пневмококковых инфекциях, вызванных штаммами с различным уровнем чувствительности к пенициллину.

Механизм резистентности S.pneumoniae к пенициллину и другим бета-лактамным антибиотикам обусловлен изменением пенициллиносвязывающих белков (ПСБ) клеточной стенки. В результате ступенчатых мутаций уменьшается сродство ПСБ к бета-лактамным антибиотикам.

При этом установлено, что при лечении инфекций дыхательных путей, вызванных штаммами S.pneumoniae с промежуточным уровнем резистентности к пенициллину, бета-лактамные антибиотики остаются клинически эффективными, но применение их при менингите приводит к неудаче терапии.

В связи с этим при разработке критериев интерпретации результатов определения чувствительности S.pneumoniae к бета-лактамным антибиотикам было проведено подразделение штаммов по источникам выделения (инфекции дыхательных путей, ликвор) и пересмотрены критерии оценки чувствительности к амоксициллину, цефотаксиму и цефтриаксону. Критерии интерпретации результатов определения чувствительности к пенициллину не пересмотрены.

Следует обратить внимание на несколько важных особенностей определения чувствительности S.pneumoniae:

невозможность определения чувствительности к бета-лактамным антибиотикам (пенициллину, аминопенициллинам, цефалоспоринам, карбапенемам) ДДМ;
невозможность определения чувствительности S.pneumoniae к АБП методом разведений в агаре.

Поэтому определение чувствительности пневмококков к пенициллину и другим бета-лактамным антибиотикам подразумевает последовательное (выделение S.pneumoniae из нестерильных локусов) или одновременное (при тяжелых инфекциях, выделении пневмококков из крови и ликвора) выполнение двух исследований:

Скрининг с диском, содержащим 1,0 мкг оксациллина, с целью выявления возможной пенициллинорезистентности. Скрининговый метод позволяет разделить микроорганизмы на две группы: группу чувствительных штаммов и группу, в которую входят часть чувствительных, а также умеренно-резистентные и резистентные штаммы пневмококков.
Определение МПК пенициллина и других бета-лактамных антибиотиков методом разведений в бульоне или с помощью Е-тестов у штаммов, отнесенных ко второй группе по результатам скрининга.

Скрининг на наличие пенициллинорезистентности у штаммов S.pneumoniae

Постановка теста. Методика проведения исследования не отличается от обычной процедуры определения чувствительности пневмококков к АБП ДДМ.

Интерпретация результатов

При выявлении диаметра зоны подавления роста штамма пневмококка вокруг диска
с 1 мкг оксациллина > 20 мм, S.pneumoniae расценивается как чувствительный ко всем бета-лактамным антибиотикам.
При выявлении диаметра зоны подавления роста < 20 мм необходимо определение МПК всех бета-лактамных антибиотиков (пенициллина, аминопенициллинов, цефалоспоринов II - IV поколенй, карбапенемов) методами серийных разведений в бульоне или с помощью Е-тестов.

Макролиды и линкозамиды. Вторыми по значимости в лечении пневмококковых инфекций являются макролидные и линкозамидные антибиотики. Оценка чувствительности S.pneumoniae к перечисленным антибиотикам возможна как диско-диффузионным методом, так и методом серийных разведений. В связи с разнообразием механизмов устойчивости S.pneumoniae к макролидам в повседневной практике могут встречаться различные варианты перекрестной резистнетности микроорганизмов к АБП этой группы.

Однако в практических целях для характеристики чувствительности S.pneumoniae к рассматриваемой группе АБП достаточно оценить чувствительность к эритромицину и клиндамицину, что позволяет дифференцировать два основных фенотипа:

MLS_B – перекрестная устойчивость ко всем макролидам, линкозамидам и стрептограминам В, обусловленная метилированием мишени действия препаратов.
М – устойчивость к 14- и 15-членным макролидам (при сохранении чувствительности к 16-членным макролидам, линкозамидам и стрептограминам), обусловленная активным выыедением АБП.

Фторхинолоны. Традиционные фторхинолоны (пефлоксацин, офлоксацин, ципрофлоксацин и ломефлоксацин) не являются адекватными для лечения пневмококковых инфекций, соответственно, оценивать чувствительность к этим препаратам нецелесообразно. В последние годы в лечении пневмококковых инфекций важное место заняли антипневмококковые фторхинолоны (левофлоксацин, спарфлоксацин, моксифлоксацин и гатифлоксацин). Частота устойчивости к перечисленным препаратам минимальна, однако, поскольку между ними не наблюдают полной перекрестной резистентности, возникает необходимость включения в исследование всей группы.

АБП других групп. Из антибиотиков других групп для лечения пневмококковых инфекций применяют ко-тримоксазол, хлорамфеникол, тетрациклины. Однако роль перечисленных препаратов в последние годы резко снижается в связи с нарастанием устойчивости, меньшей клинической эффективностью в сравнении с бета-лактамами, макролидами и антипневмококковыми фторхинолонами, также значительным числом нежелательных эффектов.

Для лечения тяжелых пневмококковых инфекций, вызванных штаммами с высоким уровнем устойчивости к антибактериальным препаратам других групп, в ряде случаев рекомендуется ванкомицин.

Критерии интерпретации результатов определения чувствительности S.pneumoniae (пограничные значения диаметров зон подавления роста и МПК АБП) приведены в таблице 17.

Определение чувствительности Streptococcus spp. группы «viridans»

Проводить определение чувствительности штаммов стрептококков группы “viridans”, выделенных из нестерильных локусов в рутинной практике нецелесообразно. У штаммов, выделенных из стерильных в норме локусов организма, необходимо, в первую очередь, исследовать чувствительность к пенициллину. Воспроизводимые результаты при определении чувствительности стрептококков группы “viridans” к пенициллину удается получить только при помощи метода серийных разведений, ДДМ не пригоден для этой цели.

Штаммы, чувствительные к этому антибиотику, следует расценивать как чувствительные ко всем бета-лактамным антибиотикам. Часть штаммов, устойчивых к пенициллину, могут сохранять чувствительность к некоторым цефалоспоринам III поколения (цефотаксиму и цефтриаксону), IV поколения (цефепиму) и карбапенемам. Однако критерии интерпретации результатов определения чувствительности в настоящее время установлены только для цефотаксима и цефтриаксона.

Определенный интерес может представлять изучение чувствительности стрептококков группы “viridans” к эритромицину и другим макролидам, клиндамицину, тетрациклину и хлорамфениколу, однако клиническое значение получаемых при этом данных не определено.

В случае сниженной чувствительности или резистентности зеленящих стрептококков к пенициллину, при выдаче результатов тестирования клиницистам целесообразно рекомендовать проведение комбинированной терапии бета-лактамами с аминогликозидами, которые проявляют синергизм при совместном применении с бета-лактамами, несмотря на отсутствие у аминогликозидов собственной значимой активности в отношении стрептококков.

Определение чувствительности бета-гемолитических стрептококков

К бета-гемолитическим стрептококкам относятся микроорганизмы, принадлежащие к различным серологическим группам по Лансфельд (А, B, C, G). Среди них наибольшее клиническое значение имеют стрептококки группы А (Streptococcus pyogenes) и группы В (Streptococcus agalactiae).

Препаратами выбора для лечения инфекций, вызванных бета-гемолитическими стрептококками, являются бета-лактамы, причем достоверных случаев устойчивости к АБП этой группы не описано. Не описана и устойчивость к ванкомицину. Следовательно, оценивать чувствительность к указанным АБП в рутинной практике нецелесообразно.

При выделении из нестерильных локусов необходимость в оценке чувствительности возникает только для S.pyogenes и S.agalactiae. Примерный перечень препаратов для определения чувствительности этих микроорганизмов включает: макролиды (эритромицин) и линкосамиды (клиндамицин). С целью мониторига антибиотикорезистентности возможно определение чувствительности к хлорамфениколу и левофлоксацину. Для бета-гемолитических стрептококков, выделенных из стерильных локусов, необходимо определять чувствительность ко всем вышеперечисленным препаратам одновременно.

Примерный перечень АБП, рекомендуемых для определения чувствительности S.pneumoniae, стрептококков группы “viridans” и бета-гемолитических стрептококков, выделенных из различных локусов организма, представлен в таблице 18.

Критерии интерпретации результатов определения чувствительности
Streptococcus spp. (кроме S.pneumoniae) (пограничные значения диаметров зон подавления роста и МПК АБП) приведены в таблице 19.

Определение чувствительности Haemophilus influenzae

Питательные среды

Для определения чувствительности Haemophilus spp. необходимо использовать только специальную питательную среду HTM (Haemophilus Test Medium), содержащую необходимые для гемофил факторы роста. Данная среда доступна из коммерческих источников. Однако ее можно приготовить на основе среды Мюллера-Хинтона в лаборатории.

Среду готовят на основе бульона или агара Мюллера-Хинтона. После растворения основы в нее добавляют дрожжевой экстракт (до конечной концентрации 5 мг/мл)
и раствор гематина (до конечной концентрации 15 мг/л). Для приготовления основного раствора гематина 50 мг порошка помещают в 100,0 мл 0,01N NaOH
(0,01 моль/л) и нагревают при тщательном перемешивании до полного растворения.
В подготовленную для автоклавирования среду на 1 л вносят 30,0 мл основного раствора гематина.
После автоклавирования и охлаждения основы до 48 – 50 ⁰С в нее асептически вносят раствор никотинамид аденин динуклеотида (НАД) до конечной концентрации
15 мг/л. Раствор НАД стерилизуют фильтрацией через мембранные фильтры
с размером пор 0,45 мкм.
При определении чувствительности к сульфаниламидам и триметоприму
в охлажденную до 48 – 50 ⁰С среду асептически вносят также раствор тимидин фосфорилазы до конечной концентрации 0,2 ед./мл.

Haemophilus spp. характеризуются природной чувствительностью к большинству распространенных антибиотиков, в том числе и к бета-лактамам. Практически важным исключением является отсутствие активности в отношении Haemophilus spp. у цефалоспоринов I поколения. Наибольшее значение имеет приобретенная резистентность к ампициллину, обусловленная продукцией плазмидных бета-лактамаз ТЕМ-1 и ROB-1. Кроме ампициллина эти ферменты частично гидролизуют цефалоспорины I поколения, но не активны в отношении препаратов II - III поколений.

Известны штаммы H.influenzae, устойчивость которых к ампициллину связана с изменением мишени действия -лактамных антибиотиков (пенициллинсвязывающих белков) или снижением проницаемости наружной клеточной стенки. Эти штаммы получили название бета-лактамазонегативные ампициллинорезистентные (БЛНАР) и считаются нечувствительными к ингибиторозащищенным пенициллинам и таким цефалоспоринам, как цефаклор, цефуроксим, цефиксим, цефтибутен. До настоящего времени не получено клинических штаммов H.influenzae, устойчивых к цефалоспоринам III – IV поколений и карбапенемам.

Для выявления ампициллинорезистентности у гемофильной палочки в рутинной лабораторной практике достаточно определения чувствительности к ампициллину диско-диффузионным методом и теста на продукцию -лактамаз с нитроцефином.

Эти два теста позволяют подразделить штаммы на ампициллиночувствительные, бета-лактамазопродуцирующие ампициллинорезистентные (чувствительные к ингибиторозащищенным пенициллинам и цефалоспоринам II – IV поколений) и БЛНАР, которые следует расценивать как резистентные к ингибиторозащищенным пенициллинам и некоторым цефалоспоринам. Причем тестирование с диском, содержащим ингибиторозащищенные пенициллины, например амоксициллин/клавуланат, не позволяет отличить БЛНАР от ампициллиночувствительных штаммов H.influenzae.

Макролидные антибиотики, в целом, отличаются невысоким уровнем активности в отношении Haemophilus spp., при этом между ними выявляются незначительные различия (наибольшая активность характерна для азитромицина). Низкий уровень активности макролидов связан с наличием у этого микроорганизма фоновой активности механизмов активного выведения. Подавляющее большинство штаммов H.influenzae с микробиологической точки зрения относятся к «дикой» популяции, лишенной дополнительных детерминант резистентности к этим АБП. Однако, in vivo, при приеме в рекомендуемых дозах концентрации макролидов в органах и тканях оказываются недостаточными для обеспечения эрадикации патогена. Учитывая приведенные факты, обоснованность критериев чувствительности H.influenzae к азитромицину и кларитромицину вызывает сомнения.

Устойчивость к фторхинолонам среди H.influenzae встречается редко, однако частота встречаемости штаммов с повышенными значениями МПК фторхинолонов возрастает, что обосновывает необходимость тестирования указанных АБП. Наиболее вероятно, что между отдельными представителями этой группы существует перекрестная резистентность, характерная и для других грамотрицательных бактерий.

Примерный перечень АБП, рекомендуемых для определения чувствительности H.influenzae, выделенных из различных локусов организма, представлен в таблице 20.

Критерии интерпретации результатов определения чувствительности
H.influenzae (пограничные значения диаметров зон подавления роста и МПК АБП) приведены в таблице 21.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 ... 14

	Инструкция по применению набора реагентов для бактериологических исследований Питательная среда предназначена для определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам диско-диффузионным...		Исследование отделяемого высыпных элементов кожи на чувствительность...
	Методические указания. Методические указания по определению расходов... Методические указания предназначены для использования инженерно-техническими работниками коммунальных теплоэнергетических предприятий...		Среды для определения чувствительности микроорганизмов к противомикробным... Ависит от качества и стандартности питательной среды. Вот почему во всем мире принято использовать среду Мюллера-Хинтон. Она была...
	Методические указания к лабораторным занятиям по дисциплине «Физико-химические... Методические указания предназначены в помощь студентам буровых специальностей очной и заочной формы обучения по приобретению практических...		Методические рекомендации мр 1 0075/1-13 Издание официальное Роспотребнадзор... «Надзор за распространением штаммов вич резистентных к антиретровирусным препаратам». – Методические рекомендации. – М.: Федеральная...
	Методические рекомендации мр 1 0075/1-13 Издание официальное Роспотребнадзор... «Надзор за распространением штаммов вич резистентных к антиретровирусным препаратам». – Методические рекомендации. – М.: Федеральная...		Методические рекомендации мр 1 0075/1-13 Издание официальное Роспотребнадзор... «Надзор за распространением штаммов вич резистентных к антиретровирусным препаратам». – Методические рекомендации. – М.: Федеральная...
	1. Наименование Наименование объекта закупки – поставка автоматизированной системы для ускоренной детекции микобактерий туберкулеза и определения...		Методические рекомендации Большие Вяземы 2013 «Усовершенствованные способы хранения штаммов Государственной коллекции фитопатогенных микроорганизмов и сортов-идентификаторов (дифференциаторов)...
	Методические указания по проведению диагностирования технического... В настоящих Методических указаниях изложены технические требования и рекомендации по проведению диагностирования технического состояния...		«Безопасная среда для пациента и персонала» Целью дезинфекции является уничтожение а всех микроорганизмов б вегетативных и споровых форм патогенных и условно патогенных микроорганизмов...
	Методические указания по определению возбудителей гельминтозоонозов... Из органов и тканей нарезают полоски длиной до 10 мм и толщиной 3-4 мм, помещают		Методические указания по газохроматографическому определению ацетальдегида в атмосферном воздухе Разработаны в. Ф. Федониной (Всесоюзный научно-исследовательский и проектный институт мономеров внипим г. Тула)
	Методические указания методические указания разработаны: Федеральной... Му 3011-12. Дезинфектология. "Неспецифическая профилактика клещевого вирусного энцефалита и иксодовых клещевых боррелиозов". Методические...		Методические указания по курсовому проектированию по дисциплине «Проектирование... Электронный ресурс]: методические указания / О. Ф. Абрамова// Сборник «Методические указания» Выпуск. Электрон текстовые дан.(1файл:...

Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам

Похожие: