Бактерии рода Clostridium
К роду Clostridium относятся подвижные палочки (реже неподвижные), величиной 1,5-20,0 мкм, с закругленными, иногда с заостренными концами, часто расположеные в парах или короткими цепочками. Образуют овальные или круглые эндоспоры, придающие клеткам веретенообразную форму (от гр. kloster — веретено). С возрастом могут изменять отношение к окрашиванию по Граму, но на ранних стадиях культивирования всегда грамположительны. Большинство видов хемоорганотрофы, но некоторые могут расти хемоавтотрофно или хемолитотрофно; одни виды проявляют сахаролитическую, другие — протеолитическую активность (возможно сочетание этих свойств либо их полное отсутствие). Наиболее характерные признаки — способность вызывать маслянокислое брожение и анаэробный распад углеводов с образованием масляной кислоты и газов (СО2 водород, иногда метан). Восстанавливают сульфиты до сульфидов. Обычно каталазоотрицательные. Большинство видов — строгие анаэробы; также имеются аэротолерантные виды или отдельные штаммы. Типовой вид — Clostridium butyricum; вызывает маслянокислое брожение углеводов, открытие этой палочки позволило Пастеру (1861) выделить анаэробные микроорганизмы. Термин «клостридии» ввел Трекюль (1863). Род включает виды, обитающие в почве, на дне пресных и соленых водоемов, в кишечнике человека и животных; некоторые виды патогенны, а некоторые нашли применение в промышленном производстве некоторых органических кислот и спиртов. Современная систематика выделяет 5 групп микроорганизмов, разделяемых по расположению спор, способности гидролизовать желатин и особым требованиям для роста. По экологическим свойствам выделяют 3 группы клостридий: возбудители бродильных процессов (с преобладанием сахаролитических свойств); возбудители процессов гниения (с преобладанием протеолитических свойств); патогенные виды (могут быть протеолитическими и сахаролитическими) Последнюю группу составляют возбудители травматических клостридиозов (газовой гангрены, столбняка), возбудители энтеральных клостридиозов и непатогенные виды, вызывающие патологические процессы в ассоциациях с другими патогенными клостридиями. Клостридиозы, как правило, имеют экзогенное происхождение. Число видов в роде достигло 100, из них менее 20 выделяют при различных поражениях животных и человека; их основные идентифицирующие признаки представлены в табл. 4.
Clostridium perfringens — один из основных видов рода. Возбудитель злокачественного отека, инфекционной энтеротоксемии животных, анаэробной дизентерии молодняка сельскохозяйственных животных, пищевых токсикоинфекций человека. По способности образовывать 4 главных токсина (-, -, - и -) микроорганизмы разделяют на 6 сероваров — А, В, С, D, Е и F (представители последнего, по-видимому, принадлежат к типу С). Основной возбудитель заболеваний человека — Clostridium perfringes типа А (С. welchii); при некротических энтеритах иногда выделяют микроорганизмы типов С и F; возбудители типа D вызывают инфекционные энтеротоксемии. Clostridium perfringens типа А открыли американские патологи Уэлч и Нэталл (1892), в чистой культуре получили Вейон и Жубер (1893), давшие ему название perfringens.
Распространение
Микроорганизмы широко распространены в окружающей среде, их выделяют из воды, почвы и сточных вод, часто обитают в кишечнике людей и животных; Clostridium perfringes также способны вегетировать в почве, богатой гумусом. Наиболее часто в почве и испражнениях обнаруживают серотип А. Место постоянного обитания представителей серотипа С, ответственных за пищевые токсикоинфекции у человека, пока не установлено, возбудителей выделяют из мясных и рыбных консервов и органов людей, умерших от «некротического энтерита».
Таблица 4. Идентифицирующие признаки патогенных для человека видов рода Clostridium
Вид
|
Споры
|
Аэробный рост
|
Лецитин
|
Липаза
|
Желатин (гидролиз)
|
Индол
|
Основные продукты метаболизма
|
Комментарии
|
С. botulinum:
|
|
|
|
|
|
|
|
|
I группа
|
ОС
|
–
|
–
|
+
|
+
|
–
|
УК, МК, иМК, иВК
|
|
II группа
|
ОС
|
–
|
–
|
+
|
+
|
–
|
УК, МК
|
|
III группа
|
ОС
|
–
|
+
|
+
|
+
|
–
|
УК, ПК, МК
|
|
IV группа
|
КC
|
–
|
–
|
–
|
+
|
–
|
УК, ПК, МК, иМК, ФУК
|
Синоним — С. aryentiense
|
С. tetani
|
ОС
|
–
|
–
|
–
|
+
|
±
|
УК, МК, ПК
|
Дает феномен роения на КА
|
С. perfringens
|
ОС
|
–
|
+
|
–
|
+
|
–
|
УК, МК
|
Редко образует споры, дает двойную зону гемолиза на КА неподвижны
|
С. difficile
|
ОС
|
–
|
–
|
–
|
±
|
–
|
УК, МК, иМК, ВК, иВК, иКК
|
|
С. sordellii
|
ОС
|
–
|
+
|
–
|
+
|
+
|
УК
|
Уреаза-положительна
|
С. novyi A
|
ОС
|
–
|
+
|
+
|
+
|
–
|
УК, ПК, МК
|
Особо чувствительна к О2
Дает -гемолиз
|
С. novyi В
|
ОС
|
–
|
+
|
–
|
+
|
–
|
УК, ПК, МК
|
|
С. histolyticum
|
ОС
|
±
|
–
|
–
|
+
|
–
|
УК
|
Не ферментирует углеводы
|
С. septicum
|
ОС
|
–
|
–
|
–
|
+
|
–
|
УК, МК
|
Дает феномен роения на КА
|
С. bifermentans
|
ОС
|
–
|
+
|
–
|
+
|
+
|
УК
|
Уреаза-отрицательна
|
С. sporogenes
|
ОС
|
–
|
–
|
+
|
+
|
–
|
УК, МК, иВК
|
|
С. tertium
|
ОС
|
+
|
–
|
–
|
–
|
–
|
УК, МК
|
|
С. ramosum
|
КС/ОС
|
–
|
–
|
–
|
–
|
–
|
УК
|
Редко образует споры, часто окрашивается грамотрицательно
|
С. butyricum
|
ОС
|
–
|
–
|
–
|
–
|
–
|
УК, МК
|
|
С. bryantii
|
КС/ОС/ТС
|
–
|
+
|
–
|
–
|
–
|
УК, МК, МолК
|
|
Примечание. Споры: ОС — овальные; КС — круглые; С — субтерминальные; ТС — терминальные. Метаболиты: УК — уксусная кислота; МК (иМК) — масляная (изомасляная) кислота; ПК — пропионовая кислота; ВК (иВК) — валериановая (изовалериановая) кислота; иКК — изокапроновая кислота; МолК — молочная кислота. КА — кровяной агар
Морфология и культуральные свойства возбудителя
Вегетативные клетки — крупные, строго грамположительные, жгутиков не имеют, неподвижны (один из немногих неподвижных видов). Классические формы представлены короткими палочками с обрубленными под прямым углом концами (0,6-1,0 1-1,5 мкм). Морфология может варьировать (антибиотики, ионы металлов, радиоактивное облучение), например, in vitro на углеводных безбелковых средах могут образовываться коккобациллярные формы, а на белковых безуглеводных средах — нити с заостренными концами длинной до 145 мкм. In vivo образуют капсулы (единственный капсулообразующий вид среди патогенных клостридий). В течение некоторого времени капсулы сохраняются и при культивировании на средах, содержащих нативный белок, наиболее выражены у вирулентных штаммов, резистентных к фагоцитарным реакциям. Хорошо окрашиваются анилиновыми красителями, в старых культурах могут быть грамотрицательными.
Споры Clostridium perfringens крупные, овальные, расположены центрально (у С. perfringens типа А — также субтерминально), клетка-спорангий практически не деформируется. Термоустойчивость спор серотипов В и D относительно невысока (погибают при кипячении в течение 15-30 минут), споры типов А и С более устойчивы и выживают при кипячении и даже автоклавировании в течение 1-6 ч. Спорообразование обычно имеет место в почве и кишечнике, in vitro споры можно получить на щелочных средах, богатых белком и не содержащих утилизируемых углеводов (например, на свернувшейся лошадиной сыворотке). Спорообразование стимулирует прогревание при 75°С в течение 10-15 минут.
Тип А. Clostridium perfringens типа А — факультативный анаэроб (в сравнении с другими клостридиями) и относительно толерантен к кратковременным кислородным воздеиствиям, хотя имеются чувствительные штаммы, погибающие при воздействии О2 на культуру в течение 3 минут. Способен расти в высоких столбиках сред без герметизации вазелином.
Морфология колоний
У Clostridium perfringens типа А значительно варьирует от условий выращивания. На плотных питательных средах обычно образуются S- и R-колонии. S-колонии круглые, сочные, куполообразные, с гладкими ровными краями, в начале роста прозрачные, напоминающие капли росы, позднее становятся мутными, серовато-белыми. R-колонии неправильной формы, бугристые, с неровными шероховатыми краями, в глубине агара напоминают комочки ваты. У некоторых штаммов отмечают слизистые М-колонии, особенно у слизистых вариантов С. perfringens типа А, образующих густую слизь на жидких средах, они напоминают S-колонии с более высоким куполом и слизистой консистенцией; представлены капсулированными клетками. Иногда можно наблюдать смешанные О-колонии.
На агаре Цейсслера через 12-18 ч образует гладкие сероватые колонии с ровными краями и плотным возвышением в центре. Колонии окружены зоной гемолиза, он может быть полным либо частичным. Зона гемолиза может быть двойной: вокруг колоний полный гемолиз (за счет действия гемолизинов), на отдалении — неполный (за счет действия лецитиназы). При контакте с кислородом колонии могут приобретать зеленоватую окраску.
На желточном агаре образует колонии, окруженные зоной перламутрового преципитата (фосфорилхолин), образующегося из лецитина куриного желтка под действием лецитиназы.
Характерный признак колоний Clostridium perfringens типа А — способность менять серовато-белый цвет на зеленовато-оливковый после кратковременного пребывания в аэробных условиях (может служить дифференциально диагностическим признаком).
Колонии в толще питательной среды имеют вид чечевичных зерен, дисков или комочков ваты.
Рост на жидких и полужидких средах, особенно содержащих глюкозу, происходит очень бурно с образованием Н2 и СО2, и обычно заканчивается через 8-12 ч; при стоянии среда постепенно светлеет и образуется обильный осадок, культуры Clostridium perfringens типа А имеют характерный запах масляной кислоты. Оптимум рН 7,2-7,4, но могут расти в интервале 5,0-8,5. Первые признаки роста на среде Китта-Тароцци могут проявляться уже через 1-2 ч (особенно при 43°С); последние проявляются появлением пузырьков газа из-под кусочков печени при встряхивании. Помутнение среды и активное газообразование можно наблюдать через 4-8 ч культивирования.
Антигенная структура
Выделяют 6 сероваров (A-F) Clostridium perfringens, различающихся по антигенным свойствам продуцируемых экзотоксинов. Все серовары образуют -токсин (лецитиназу). Тип А включает много подтипов, идентифицируемых реакциями агглютинации, что облегчает диагностику в случаях пищевых токсикоинфекций и анаэробных раневых инфекций.
Метаболическая активность
Clostridium perfringens расщепляет с образованием кислоты и газа глюкозу, ксилозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, раффинозу, маннозу, крахмал, гликоген и инозит; глицерин разлагают не все штаммы, не сбраживает маннит, дульцит; редко ферментирует салицин и инсулин. От прочих клостридий С. perfringens отличает способность восстанавливать нитраты, расщеплять лактозу, образовывать лецитиназу. Протеолитическая активность слабая; разжижает желатин, не разлагает казеин; только некоторые штаммы медленно разжижают свернувшуюся сыворотку. Интенсивно створаживают молоко с образованием крупноячеистого губчатого сгустка уже через 3 ч (феномен известен как «штормовая реакция»)
Патогенность
Для человека патогенны Clostridium perfringens типов А, С и D; типы В,С, D и Е вызывают аналогичные заболевания у сельскохозяйственных животных (табл. 5).
Таблица 5. Заболевания, вызываемые С. perfringens
ТИП
|
Заболевание
|
A
|
Газовая гангрена людей и животных, пищевые токсикоинфекции
|
B
|
Дизентерия молодняка сельскохозяйственных животных, энтеротоксемия овец и коз
|
C
|
Некротический энтерит человека, геморрагическая энтеротоксемия овец, коз, поросят и телят
|
D
|
Инфекционная энтеротоксемия человека, овец, коз, кроликов, телят, «травяная болезнь» лошадей
|
E
|
Энтеротоксемия телят и ягнят
|
Токсины и клинические проявления
Токсины. Clostridium perfringens образует как минимум 12 идентифицированных токсинов (ферментов) и энтеротоксин; у гиалуронидазы и дезоксирибонуклеазы (- и - токсины) токсичность не доказана; -, -, -, -, , - и -токсины обладают летальным свойством, но их биохимическая активность изучена недостаточно, и только -, - и -токсины – ферменты с выраженным токсическим действием. Мишени для действия основных токсинов — биологические мембраны в различных тканях, в основе поражения находятся ферментативные процессы, катализирующие гидролитическое расщепление и нарушение клеточной проницаемости с последующим отеком. Последний сопровождается снижением окислительно-восстановительного потенциала в клетках, активацией эндогенных протеаз, приводящих к аутолизу тканей, характерному для газовой гангрены.
-Токсин (лецитиназа С) проявляет дерматонекротизирующее, гемолитическое и летальное (убивает лабораторных животных при внутривенном введении) действие, опосредованное лецитиназной (фосфолипазной) активностью (разлагает лецитин на фосфорилхолин и глицериды), продуцируют все типы Clostridium perfringens, но наиболее интенсивно тип А.
-Токсин вызывает некроз тканей и оказывает летальное действие на морских свинок-альбиносов, гемолитического действия не оказывает, активность in vivo реализуется в развитии некротических энтеритов, основные продуценты — типы В и С.
-Токсин проявляет гемолитическую активность в отношении эритроцитов барана, но не в отношении эритроцитов кролика или лошади, оказывает летальное действие на лабораторных животных, основные продуценты — типы В и С.
-Токсин оказывает гемолитическое (кислород-чувствительное), дерматонекротизирующее и летальное действие, разрушает эритроциты барана и лошади, а также (незначительно) мыши, основной продуцент — Clostridium perfringens типа С, типы А, В, D и Е образуют его в меньших количествах.
- и -токсины оказывают летальное и дерматонекротизирующее действие, протоксины, выявляемые в фильтратах культур, активируются трипсином. -токсин продуцируют типы В и D, -токсин — штаммы типа Е.
-токсин (коллагеназа и желатиназа) разрушает ретикулярную ткань мышц и коллагеновые волокна соединительной ткани, активно усиливает цистеин в присутствии Fe2+, оказывает летальное и некротизирующее действие, продуценты — типы А, С, Е и некоторые штаммы типа D.
-токсин (протеиназа) расщепляет денатурированный коллаген и желатин, во многом действует подобно фибринолизину, как и -токсин, секретируется в форме протоксина, активируемого трипсином. Проявляет активность экзоэнзима, обусловливающего некротические свойства.
-и -токсины оказывают летальное действие на лабораторных животных; их биохимическая природа остается неизвестной.
- и -токсины по своей химической природе — гиалуронидаза и дезоксирибонуклеаза, -токсин ответствен за повышение проницаемости тканей, -токсин расщепляет нуклеиновые кислоты, тем самым нарушая реакции белкового синтеза. Фильтраты микробных культур Clostridium perfringens могут содержать также различные токсические вещества (например, фибринолизин и гиалуронидазу).
Энтеротоксин образуют Clostridium perfringens типов А и С, вызывающие пищевые токсикоинфекции, по своей природе он термолабильный протеин, продуцируемый при споруляции бактерий в толстой кишке, его практически не образуют лабораторные культуры, и он быстро разрушается при термической обработке пищевых продуктов, что значительно затрудняет его биохимическое изучение и идентификацию; вызывает рвоту и диарею, оказывает летальное действие, а также обусловливает появление эритематозной кожной сыпи у лабораторных животных. Диарея развивается вследствие потери воды и электролитов за счет дилатации и повышения проницаемости капилляров.
Газовая гангрена развивается при попадании Clostridium perfringens на раневые поверхности, где бактерии активно размножаются в условиях пониженного содержания кислорода. Микроорганизмы, а чаще их споры, могут быть занесены в раны из внешней среды, а также с кожи или из ЖКТ пациента Для поражений характерны некроз тканей и образование газа с гнилостным запахом. Обильное образование газа характерно преимущественно для анаэробных раневых инфекций, вызванных данным микроорганизмом, известным также как палочка газовой гангрены. Характерная особенность гистологических препаратов, полученных из очагов поражения — практически полное отсутствие фагоцитов в очаге некротических поражений.
Пищевые токсикоинфекции, вызванные серотипами А и С, приобретают все большую значимость и представляют актуальную проблему для здравоохранения большинства стран мира.
Clostridium perfringens типа А вызывает преимущественно токсикоинфекции легкой и средней тяжести, инкубационный период составляет 6-24 ч; заболевания развиваются остро, с ощущениями боли в животе, рвотой (иногда с кровью) и диареей (до 20 раз в сутки), общие нарушения проявляются слабостью, головокружениями, повышение температуры наблюдают редко. Симптомы исчезают в последующие 12-24 ч. Летальные исходы наблюдают редко, обычно у ослабленных пациентов — пожилых лиц, хронических больных и детей с нарушениями питания. Следует помнить о способности микроорганизмов проникать в кровоток и вызывать тяжелый анаэробный сепсис.
Более тяжело протекает некротический энтерит, вызванный штаммами серотипа С. При острых формах болезнь может закончиться смертью пациента в течение 12-24 ч. Симптомы аналогичны поражениям, вызываемым бактериями серотипа А, и обусловлены действием -токсина, подобные пациенты нередко попадают на операционный стол с диагнозом «кишечная непроходимость», смертность достигает 35%. Заболевание регистрируют достаточно редко; большое число случаев наблюдали в Германии после второй мировой войны (в 1945-1948 гг. — 1056 случаев), а в настоящее время периодически отмечают в Новой Гвинее, что связано с особенностями национальной кухни.
Термоустойчивость спор. Даже внутри серотипа А она может меняться в зависимости от штамма.
При варке мяса некоторые споры погибают в течение нескольких минут, тогда как другие выдерживают кипячение в течение часа и дольше (особенности штамма). Споры, находящиеся в жировой ткани, выживают на протяжении длительного времени (до 6 часов).
Повышение температуры до 75°С стимулирует прорастание спор, температурный оптимум для роста в вареном мясе 43°С, в оптимальных условиях дочерние популяции образуются в течение 12-13 минут.
Лабораторная диагностика
В соответствии с методическими указаниями по лабораторной диагностике (1979) предусмотрено обнаружение и идентификация токсина в содержимом тонкого кишечника в реакции нейтрализации на белых мышах. Параллельно проводится выделение и идентификация возбудителя по тинкториальным, культуральным и токсигенным свойствам, изучение ферментативных свойств не предусмотрено. Используются лабораторные животные.
Выделение проводят по общепринятой схеме (рис. 2). При смешанных инфекциях можно прогреть исследуемый материал и выделить Clostridium perfringens из термоустойчивых спор, внесенных в питательную среду, с последующим развернутым анализом.
Идентификация микроорганизма осуществляется набором стандартных тестов — подвижность, серологические реакции и др.; Clostridium perfingens также можно идентифицировать по росту на яичном агаре: колонии С. perfringens окружены опалесцирующим белым «преципитатом», появляющимся под действием -токсина (лецитиназы С); образование зон преципитации можно ингибировать, наслоив на половину чашки специфическую антисыворотку одновременно с посевом тест-культуры.
Рисунок 2. Схема бактериологического исследования на Clostridium perfringens
|
