Практикум по ветеринарной микробиологии
|
Скачать 3.35 Mb.
|
Тема 5. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВМикроорганизмы, выращенные в лабораторных условиях, называют микробными культурами. Для получения культуры исследуемый материал (кровь, эмульсия тканей, отечная жидкость, гной, молоко и др.) высевают на стерильные питательные среды в пробирках, колбах или чашках Петри и помещают на определенное время в специальные шкафы-термостаты, где постоянно поддерживается необходимая для разных групп микробов температура (37...38°С;26...30оС;22...25°С). Оборудование для культивирования. Лабораторный термостат (рис.31) представляет собой двустенный шкаф, снаружи покрытый теплоизоляционным материалом (пластиком). Термостаты могут быть водяные и суховоздушные. В водяном термостате между двойными стенками заливают воду (обычно дистиллированную), в суховоздушном от нагретой внутренней металлической обшивки нагревается циркулирующий внутри воздух. Нагретые вода или воздух через внутреннюю металлическую стенку передают теплоту внутрь шкафа. Подключают термостат к электросети, так как в нижней части его между стенками вмонтированы электрообогреватели. Внутри термостата имеется несколько сетчатых полочек, на которые помещают штативы или специальные, корзиночки с пробирками, колбы, чашки Петри, эксикаторы, микроанаэростаты с посевами. Температура в термостате поддерживается при помощи терморегулятора. При повышении температуры выше нужного уровня терморегулятор автоматически выключает обогреватель, а при понижении — включает его. Терморегуляторы могут быть биметаллические, «подушечные» и контактные (ртутные). Биметаллический терморегулятор состоит из двух спаянных между собой цинковой и латунной пластинок, изогнутых U-об-разно. Одна ветвь этой пластинки прикрепляется неподвижно к внутренней стенке термостата, вторая — свободная, подвижная, с электроконтактом находится на очень близком расстоянии от клеммы, соединенной с электросетью. При нагревании термостата в силу различного коэффициента расширения цинковой и латунной пластинок подвижная ветвь, отклоняясь в сторону, выключает обогревание термостата. Температуру в термостате предварительно регулируют установлением клеммы на определенное расстояние от свободной пластинки терморегулятора.  Принцип действия у «ло-душечных» терморегуляторов основан на том, что плоская Рнс. 31. Термостат: контактный термометр; 2—дверцы термостата; 3— полки латунная гофрированная коробочка с запаянной в ней жидкостью укрепляется таким образом со специальным устройством, что при нагревании выше заданной температуры жидкость в коробочке, расширяясь, оказывает давление на ее стенки и происходит отключение от сети. По мере охлаждения термостата жидкость в коробочке также охлаждается и не давит на ее стенки («подушечки»), поэтому стержень с рычажком, к которому плотно подходит «подушечка», включаются в сеть обогревания. В современных термостатах обычно применяют контактный терморегулятор — ртутный термометр с впаянными с двух сторон платиновыми проволоками. Один конец проволоки достигает канала термометра, а другой заканчивается снаружи клеммой. Проволоку с помощью наружного магнита располагают на различном уровне от столбика ртути в термометре, и температура автоматически поддерживается в термостате. Для культивирования анаэробов и микроаэрофильных бактерий используют эксикатор и анаэростат. Эксикатор представляет собой стеклянный сосуд с притертой крышкой. На его дно ставят часовое стекло или открытую чашку Петри с химическими веществами, которые активно связывают кислород воздуха [например, пирогаллол с гидроксидом (едким натром)]. Сверху на специальный выступ эксикатора кладут фарфоровую подставку с отверстиями, а на нее пробирки или чашки с посевами и плотно закрывают крышку. Для герметичности края эксикатора смазывают вазелином; затем эксикатор помещают в термостат.  Анаэростат (рис. 32) — металлический герметически закрывающийся цилиндрический сосуд, снабженный кранами для удаления воздуха или подачи нужного для работы газа (СО2, Ni, О2 и др.) и вакуум-манометром. Посевы помещают внутрь цилиндра, закрывают крышкой и с помощью насоса из анаэростата удаляют воздух. Степень разрежения внутри прибора показывает вакуум-манометр в миллиметрах ртутного столба (от 0 до 760). Анаэростат с посевами также ставят в термостат. Питательные среды. Техника посева микроорганизмов. Любая микробиологическая работа и, следовательно, выполнение любой практической задачи связаны с приготовлением питательных сред для выращивания микроорганиз- Рис. 32. Анаэростат: / — манометр; 2— кран для отвода воздуха; 3 — крышка; 4— емкость для размещения посевов мов. Среды необходимы для накопления, выделения и сохранения микроорганизмов, а также для выращивания культур с целью исследования их обмена веществ или получения биологических препаратов и ценных продуктов метаболизма. Среда должна содержать все компоненты, необходимые для конструктивных и энергетических процессов клетки: источники углерода, азота, зольные элементы, микроэлементы. Синтетические возможности микроорганизмов и способы получения ими энергии разнообразны, поэтому очень разнятся их потребности в источниках питания. Следовательно, универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех без исключения микроорганизмов, не существует. Разнообразие обмена веществ микроорганизмов обусловлено источниками углерода и азота; вот почему эти элементы представлены в средах различными веществами и именно они определяют специфичность сред. Автотрофные микроорганизмы способны использовать в качестве единственного источника углерода диоксид углерода или карбонаты, тогда как потребность в углероде гетеротрофных микроорганизмов данные соединения углерода не могут удовлетворить. Для развития гетеротрофных микроорганизмов среда должна содержать более восстановленные соединения углерода, которые в зависимости от физиолога-биохимических особенностей организма могут быть представлены различными органическими соединениями, например кислотами, спиртами, углеводами, углеводородами. Неодинаковы требования микроорганизмов и к источнику азота. В состав всех сред входят различные азотсодержащие соединения. Это могут быть нитраты или соли аммония, одна или несколько аминокислот. Наконец, известны микроорганизмы, нуждающиеся в полном наборе аминокислот или белках. Потребности разнообразных групп микроорганизмов в зольных элементах и микроэлементах удовлетворяются обычно за счет одних и тех же минеральных солей. Поэтому так называемый «минеральный фон» сред для многих микроорганизмов может быть очень близким по составу. Кроме элементов, необходимьтх для конструктивных процессов, среда должна содержать и энергетический материал. В средах для культивирования гетеротрофных организмов соединения углерода в большинстве случаев служат и энергетическим материалом. В средах для хемоавтотрофных организмов эту роль выполняют минеральные соли. Из вышесказанного ясно, что при составлении сред следует обязательно учитывать особенности обмена веществ микроорганизмов. Кроме того, среды для одного и того же микроорганизма могут отличаться в зависимости от цели исследования. Например, среда для длительного сохранения микроорганизма в лабораторных условиях заметно отличается от сред, предназначенных для получения тех или иных продуктов обмена веществ. Однако какой полноценной ни была бы среда, ее компоненты могут остаться недоступными, если активная кислотность среды (рН) не соответствует значениям, при которых возможно развитие изучаемых микроорганизмов. Поэтому в приготовленной среде проверяют значение рН и, если необходимо, доводят его до нужной величины растворами кислот (HCi, H2SO4), щелочей (NaOH, КОН) или солей, имеющих щелочную реакцию (Na2CO3, >JaHCO5). В процессе стерилизации рН сред может изменяться, поэтому нередко требуется дополнительное определение его в стерильных средах и в случае надобности корректирование стерильными растворами кислоты или щелочи. i Среды для культивирования в зависимости от состава составляют две группы; 1) естественные (натуральные) среды неопределенного или искусственного состава, 2) синтетические среды. Натуральные среды используют главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагностических целей. Примерами натуральных сред неопределенного состава, которые широко применяют в лабораторной практике, служат мясопептонный бульон, агар, неохмеленное пивное сусло, дрожжевая и картофельная среды. (Необходимость культивирования микробов обусловлена не только выделением возбудителя болезни из исследуемого материала и определением его вида, но и накоплением микробной массы для изготовления биологических препаратов: вакцин, антигенов и аллергенов. Для культивирования микроорганизмов в лабораторных условиях применяют различные искусственные питательные среды. Питательные среды бывают: по консистенции — жидкие, плотные, полужидкие; по происхождению —животного, растительного происхождения и синтетические среды постоянного состава; по назначению —обычные, или простые, для выращивания большинства микроорганизмов; специальные — для культивирования микробов, не растущих или плохо растущих на обычных питательных средах; дифференциально-диагностические — употребляемые для определения родовых или видовых особенностей исследуемых бактериальных культур (гемолитических, сахаролитических, про-теолитических, редуцирующих и других свойств); селективные — для выделения микробов одного рода или вида из материала, содержащего смесь разных видов микроорганизмов, на которых одни виды хорошо растут, а другие не растут; среды обогащения (накопительные). Основу многих питательных сред животного происхождения составляет мясная вода. Ее готовят из свежего нежирного говяжьего мяса, не содержащего костей, фасций, сухожилий. Измельченное мясо (мелкие кусочки или фарш) заливают дистиллированной водой в соотношении 1 : 2 (на 1 кг мяса 2 л воды). Экстрагируют 12...24 ч, кипятят 1,5...2 ч, фильтруют, добавляют дистиллированную воду до первоначального объема, разливают в бутыли, колбы, закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют в автоклаве. Обычные (простые) среды. Мясопептонный бульон (МПБ) — жидкая питательная среда. Для его приготовления к I л мясной воды добавляют 1 % пептона, 0,5 % химически чистой поваренной соли и кипятят. Мясная вода слабокислой реакции, поэтому МПБ подщелачивают — добавляют небольшое количество 10—15%-го раствора КОН или NaOH, кипятят 2...3 мин, проверяют рН электропотенциометром. Мясопептонный бульон фильтруют через бумажный фильтр, разливают по пробиркам, автоклави-руют. Мясопептонный агар (МПА) — плотная питательная среда. К МПБ добавляют 2 % агар-агара (безазотистое органическое вещество, полученное из морских водорослей) и кипятят до его расплавления, в горячем виде определяют рН, кипятят еще 5... 10 мин, фильтруют в горячем виде через ватно-марлевый фильтр, разливают в пробирки или колбочки, автоклавируют. После стерилизации горячие пробирки с агаром укладывают наклонно под углом 5...6 "С: при застывании образуется скошенная плотная поверхность. Для посева на агаровые пластинки его заливают в чашки Петри (рис. 33). Мясопептонный полужидкий агар готовят так же, как и МПА; различие заключается в том, что агар-агара добавляют меньше — 0,15...0,25 %. Специальные питательные среды. Бульон Мартена. Свиные желудки (или сычуги рогатого скота) очищают от жира, фасций, измельчают в мясорубке, заливают водой (1 : 4) и добавляют 1 % (к объему жидкости) соляной кислоты. Смесь выдерживают при 50 "С 24 ч, нейтрализуют 20%-м раствором NaOH до щелочной реакции по лакмусу, автоклавируют при 120 X 15 мин. Для приготовления бульона смешивают равные объемы мясной воды и полученной смеси, кипятят 10 мин, подщелачивают 20%-м раствором NaOH до рН 7,9, кипятят 30 мин, фильтруют, разливают в пробирки, автоклавируют при 50,6 кПа (110 °С) 30 мин. Агар Мартена. Добавление 2 % агара обеспечивает получение плотной среды.  Бульон Хоттингера. Готовят из триптического гидро-лизата (перевара) мясных отходов—фасций, жира, сухожилий:
охлаждают ДО 45 °С И добавляют Рис. 33. Разлив агара в чашки Петри 5...10 г панкреатина, подщелачивают до рН 7,8...8,0 бикарбонатом натрия, встряхивают и доливают хлороформ ( 10 мл на 1 л), плотно закрывают, выдерживают в теплом месте Юсут, ежедневно встряхивая. Полученный перевар подкисляют соляной кислотой до рН 5,5. Хранят в темном месте. Для приготовления питательной среды к 1 л воды добавляют 100...200 мл полученного перевара, кипятят 1...2 мин, фильтруют, подщелачивают, стерилизуют. Агар Хоттингера готовят так же, как и обычный МПА. Сахарный (глюкозный) бульон (или агар). Изготавливают, как обычные среды, но добавляют 1...2 % глюкозы и стерилизуют текучим паром или автоклавируют при 50,6 кПа. Мясопептонная желатина (МПЖ). К М ПБ добавляют 10...20 % желатины (продукт, получаемый из клейдающих тканей животных), расплавляют, устанавливают нужную реакцию горячей среды, пропускают через ватно-марлевый фильтр, разливают в пробирки, стерилизуют текучим паром дробно. Мясопептонный печеночный бульон К и т т а-Т а р о ц ц и. Жидкая среда для культивирования анаэробов. Печень крупного рогатого скота нарезают мелкими кусочками, заливают водой (1: 1), кипятят, фильтруют. Затем печеночную воду добавляют в МП Б (2 : I) (на 2 л МПБ I л печеночного отвара), кипятят, устанавливают рН, разливают по пробиркам высоким столбиком, в которые предварительно положены кусочки вареной печени. В пробирки поверх среды наливают 1...2 мл вазелинового масла и стерилизуют в автоклаве при 4,9 Па 30 мин. Сывороточный бульон и сывороточный мясопептонный агар. В МПБ или расплавленный и охлажденный до 45...50Х МПА асептически добавляют 5...10% стерильной сыворотки крови лошади (или барана, кролика), затем сывороточный бульон разливают в стерильные пробирки. Сывороточный МПА разливают в пробирки (столбиком) или в чашки Петри. Дифференциально-диагностические среды. Кровяной МПА. Применяют для выявления гемолитических свойств бактерий. Предварительно в стерильную колбочку со стеклянными бусами асептично берут кровь (у барана, лошади или кролика) и встряхивают 15...20 мин, чтобы фибрин отделить от остальной массы крови (фибрин сгустками осаждается на бусах). Дефибри-нированную кровь (5...10 %) стерильно добавляют к расплавленному и остуженному МПА, легким вращением колбочки равномерно смешивают и разливают в стерильные чашки Петри. Среды Гисса. В пептонную воду (дистиллированная вода, 0,5 % натрия хлорида и 1 % пептона) добавляют 0,5%-й раствор углевода (сахар или многоатомный спирт) и 0,5%-й раствор индикатора Андрэдэ. Обычно готовят набор сред из разных углеводов, каждую в отдельности. Используемый индикатор представляет собой 0,5 г кислого фуксина, 16 мл 4%-го раствора NaOH, 100 мл дистиллированной воды. Среды с углеводами разливают в пробирки с поплавками, опущенными в пробирки вверх дном. Стерилизуют среды с углеводами текучим паром дробно. Среды Гисса могут быть жидкими и полужидкими (без газов), содержащими 0,25 % агара. При ферментации того или иного углевода микробом, растущим в данной среде, образуется кислота, под действием которой восстанавливается цвет краски индикатора. Среда приобретает красный цвет. Образовавшиеся при ферментации углевода газообразные продукты скапливаются в поплавках. Среда Эндо. В расплавленный МПА (рН 7,4...7,6) вносят 0,5...1%-й раствор лактозы и 0,5 % насыщенного спиртового раствора основного фуксина, обесцвеченного добавлением по каплям 10 % сернокислого натрия. Среду кипятят и разливают в чашки Петри. Бактерии, сбраживающие лактозу, растут в виде красных колоний. Среда Левина. Приготовленный 2%-й агар на бульоне Хоттингера (рН 7,2...7,4) стерилизуют в автоклаве. К 100 мл готового расплавленного агара добавляют 2 мл 0,5%-го раствора мети-леновой сини, 1,5 мл 2%-го эозина (щелочного бактериологического), 2 г лактозы и 0,2 г двухосновного фосфорнокислого калия (К2НРО4). Растворы красителей готовят на дистиллированной воде и стерилизуют в аппарате Коха. Раствор метиленовой сини перед употреблением подогревают на водяной бане и добавляют в агар в теплом виде. После добавления этих компонентов среду тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Среда фиолетового цвета. Висмут-сульфит агар (среда Вильсона—Блера). Представляет собой МПА (рН 7,5) с индикатором, содержащим цитрат висмута, сульфат натрия, соль Мора (серно-аммонийная соль железа), двухосновной фосфат натрия, глюкозу и бриллиантовую зелень. В настоящее время висмут-сульфит агар (как и агар Эндо, среду Плоскирева) промышленность выпускает в сухом порошкообразном виде: 6 г сухого порошка растворяют в 100 мл дистиллированной воды, подогревают при непрерывном помешивании, разливают в стерильные пробирки и оставляют в наклонном положении. Применяют также среды с химическими веществами, которые изменяют окраску в результате окислительно-восстановительных (редуцирующих) процессов, обусловленных ферментами бактерий. Для этого готовят молоко с метиленовой синью. Свежее обезжиренное коровье молоко подщелачивают бикарбонатом (NaHCO3) натрия до слабощелочной реакции по лакмусовой бумаге, добавляют 1%-й водный раствор метиленовой сини до голубого окрашивания. Стерилизуют текучим паром дробно. Среды накопления (обогащения) используют, если предполагается, что в исследуемом материале присутствует небольшое число бактерий. Среда Шустовой: к МПА (рН 7,4) добавляют 10 % 50%-го водного раствора гипосульфита и 2 % раствора Л юго-ля. Применяют для накопления сальмонелл. Среда Раппопорта: к МПБ добавляют 1 % глюкозы, 10 % желчи и 3 % индикатора Андрэде. Стерилизуют текучим паром. Синтетические среды. Применяют для изучения процессов метаболизма и других биологических особенностей бактерий. В их состав входят химически чистые растворимые в воде вещества в строго определенных количествах: фосфат (фосфорнокислый) аммоний, фосфат калия, хлорид натрия, сульфат магния, глюкоза или другие углеводы, никотинамид и др. По мере необходимости готовят плотные синтетические среды путем добавления агара. Стерилизуют в автоклаве. Для культивирования дрожжей и плесневых грибов используют следующие среды. Синтетическая среда Ван-Итерсона: нитрита аммония (NaH4NO3) 0,5 г, нитрата калия одноосновного {КН3РО4) 0,5 г, воды водопроводной 1 л; автоклавируют при 101,6 кПа 20 мин. Глюкозный агар Сабур о: глюкозы 4,0 г, пептона 1,0 г, агара 1,8 г, воды 100 мл. Стерилизуют автоклавированием. Агар Литмана с бычьей ж е л ч ь ю: пептона 10,0, глюкозы 10,0, обезвоженной бычьей желчи 15 мл, кристаллвиоле-та 0,01, воды I л, агара 20,0. Стерилизуют в автоклаве при 1 атм 15 мин. Разливают в чашки толстым слоем, чтобы предупредить обезвоживание среды. Осветление сред. Осветленные агаризованные или желатиновые среды необходимы в диагностических исследованиях и для получения хорошо видимых изолированных колоний анаэробных микроорганизмов. В ряде случаев прозрачную среду можно получить, отфильтровав ее от осадка через вату. Когда этого бывает недостаточно, среды осветляют с помощью белков куриных яиц. Для осветления 500 мл среды достаточно белка одного яйца. Белок тщательно отделяют от желтка и встряхивают с равным объемом воды до образования густой пены. Взбитый белок выливают в предварительно расплавленную и затем остуженную до 45...50 °С среду. Перед внесением белка проверяют значение рН среды и, если необходимо, среду подщелачивают до рН 7,0...7,3. Среду с белком тщательно перемешивают и прогревают в кипящей водяной бане в течение 1 ч. Белок свертывается и адсорбирует все взвешенные в среде частицы. Среду быстро отфильтровывают в горячем виде через вату. При этом лучше всего пользоваться специально подогреваемыми подставками для воронок, которые предотвращают застывание среды во время фильтрования. Синтетические агаризованные среды, внесение белка в которые нежелательно, осветляют следующим образом. Среду, налитую в химический стакан, автоклавируют и оставляют после стерилизации в закрытом автоклаве на 10...12 ч. При таком медленном остывании среды все взвешенные частицы оседают на дно. Застывшую агаризованную среду извлекают из стакана. Верхнюю прозрачную часть среды срезают, помещают в колбу и вновь стерилизуют. Определение активной кислотности среды. Активную кислотность среды (рН) обычно определяют электрометрически, кроме того, можно выборочно в 2...3 пробирках —колориметрически. Для электрометрического определения рН растворов широко используют лабораторный потенциометр ЛПУ-01, в котором для измерения величины рН предназначена электродная система со стеклянным электродом. Стеклянный электрод представляет собой трубку с напаянным на конус полым шариком из литиевого электродного стекла. При погружении электрода в раствор между поверхностью шарика электрода и раствором происходит обмен ионами, в результате которого ионы лития в поверхностных слоях стекла замещаются ионами водорода и стеклянный электрод приобретает свойства водородного электрода. Между поверхностью стекла и исследуемым раствором возникает разность потенциалов, величина которой определяется активностью ионов водорода в растворе. Для создания электрической цепи используют внутренний электрод, осуществляющий электрический контакт с раствором, заполняющим внутреннюю часть стеклянного электрода, и внешний (вспомогательный) электрод, осуществляющий электрический контакт с исследуемым раствором. Для защиты от воздействия высоких температур вспомогательный электрод помещают вне исследуемого раствора и соединяют с ним при помощи электролитического ключа —трубки, заполненной насыщенным раствором хлорида калия и заканчивающейся пористой перегородкой. Раствор КС1 непрерывно просачивается через пористую перегородку, предотвращая проникновение из исследуемого раствора в систему электрода посторонних ионов, которые могут изменить электродвижущую силу (ЭДС) электрода. Суммарная ЭДС электродной системы линейно зависит от величины рН раствора. Определяют рН исследуемого раствора, измеряя ЭДС электродной системы с помощью электронного милливольтметра, шкала которого градуирована в единицах рН. Потенциометр ЛПУ-01 имеет устройство для ручной и автоматической коррекции показаний прибора при изменении температуры. При измерении рН растворов, температура которых отличается от комнатной, следует применять автоматическую температурную компенсацию либо при каждом измерении устанавливать указатель ручного корректора на температуру исследуемого раствора. При работе с автоматическим термокомпенсатором последний должен быть погружен в исследуемый раствор не менее чем на 40 мм. Элементы измерительной схемы прибора и его электронный усилитель размешены в металлическом корпусе, а элементы управления прибором выведены на переднюю панель. Техника посева микробов. Для получения бактериальных культур из молока, масла, сена, силоса, воды, гноя и тканей погибших животных делают посев на стерильные питательные среды. Манипуляцию проводят обязательно вблизи горящей газовой или спиртовой горелки, чтобы во время посева избежать бактериального загрязнения извне. Посев производят петлей или пастеровской пипеткой. Поступающий в лабораторию для исследования материал регистрируют в специальном журнале. Перед посевом необходимо тщательно сделать надпись на пробирке (колбе или чашке Петри) с указанием номера экспертизы, названия микроорганизма и даты посева. Надпись делают чернилами по стеклу или наклеивают этикетку. Бактериологический материал для посева или приготовления препаратов берут бактериологической петлей или иглой, если микроорганизмы выращены на плотной среде; для взятия клеток из жидкой среды чаще используют стерильные пипетки. Бактериологические петли иглы сделаны из тонкой платиновой или нихромовой проволоки, которую закрепляют в металлическом держателе или впаивают в стеклянную палочку. Диаметр бактериологической петли составляет 2...4 мм. Бактериологическую петлю (иглу) перед взятием клеток микроорганизмов стерилизуют. Для этого проволоку прокаливают докрасна в пламени горелки и одновременно обжигают примыкающую к петле часть держателя, которая будет вводиться внутрь сосуда, содержащего микроорганизмы. При прокаливании петлю держат в пламени почти вертикально, чтобы вся проволока была равномерно раскалена. Сразу же после стерилизации петлю (иглу) вводят в сосуд с микроорганизмами. Чтобы не повредить клетки микроорганизмов, петлю (иглу) вначале охлаждают, прикасаясь к внутренней поверхности сосуда или к питательной среде, где отсутствует рост, и только после этого захватывают небольшое количество микробной массы. Отбор клеток микроорганизмов, выращенных на плотной среде в пробирке, осуществляют следующим образом. Пробирку с культурой берут в левую руку таким образом, чтобы поверхность питательной среды с налетом выросших микроорганизмов была обращена кверху и хорошо видна. Пробирку держат в горизонтальном или несколько наклонном положении. В правую руку берут петлю и держат ее как карандаш, прокаливают в пламени горелки. Затем, не выпуская петли, мизинцем и безымянным пальцем правой руки прижимают наружный конец ватной пробки к ладони и вынимают пробку из пробирки. Края открытой пробирки слегка обжигают в пламени горелки, вводят в пробирку стерильную петлю и, отобрав небольшое количество микробной массы, вынимают петлю из пробирки. Горлышко пробирки снова обжигают в пламени горелки, затем обжигают внутренний конец ватной пробки и закрывают ею пробирку, которую ставят в штатив, а извлеченный материал используют для приготовления препарата. Клетки микроорганизмов, оставшиеся на петле после приготовления препарата, сжигают в пламени горелки. В этом случае прокаливание петли начинают с участка проволоки, примыкающего к кольцу, чтобы клетки, оставшиеся на петле, подсохли и не образовали аэрозоль, загрязняющий воздух. Затем петлю переводят в вертикальное положение, прокаливают докрасна и только после этого ставят на место. Клетки микроорганизмов, выросшие в жидкой среде, отбирают стерильной пипеткой, реже — петлей. Для этого пипетку вынимают за верхний конец из бумаги, в которой она стерилизовалась, и берут средним и большим пальцами правой руки. В левую руку берут пробирку (колбу) с жидкой средой, открывают пробку, соблюдая все предосторожности, описанные выше, пипетку вводят в сосуд. Отобрав часть среды, закрывают сосуд пробкой. Взятую пробу используют для приготовления препарата или посева в свежую питательную среду. После этого пипетку немедленно помещают в дезинфицирующий раствор (0,5...3%-й водный раствор хлорамина или 3...5%-й водный раствор фенола), не касаясь ею окружающих предметов. При пересеве клеток микроорганизмов с одной среды на другую в левую руку удобно взять две пробирки — одну со стерильной средой (дальше от себя), другую —с культурой микроорганизмов (ближе к себе), а в правую руку — бактериологическую петлю. Стерилизуют петлю в пламени горелки, затем, прижав пробки двух пробирок к ладони мизинцем и безымянным пальцами правой руки, открывают пробирки. Бактериологической петлей отбирают клетки микроорганизмов и вводят петлю в пробирку со стерильной скошенной средой почти до дна; петлю выводят вверх зигзагообразно или прямо (штрих). Посев иглой осуществляют в такой же последовательности, как и посев петлей, с той лишь разницей, что в толщу плотной среды делают укол. Если посев делают в жидкую среду, то пробирки держат почти вертикально, чтобы не замочить пробки. Петлю с клетками микроорганизмов погружают непосредственно в среду. Все описанные выше манипуляции проводят около пламени горелки (но не в пламени!) по возможности быстро, чтобы не загрязнить культуру посторонними микроорганизмами. Не следует делать резких движений, ходить около проводящего посев микроорганизмов, так как движение воздуха увеличивает вероятность случайного загрязнения культуры. При посеве в жидкие среды (молоко, МПБ) в левой руке держат пробирку в таком же положении, как и при изготовлении препарата-мазка; в правой руке находится петля (или пипетка) с засеваемым материалом и пробка пробирки. Около пламени горелки петлю с каплей материала (или пипетку) вносят в пробирку со средой, слегка погружая в нее. Закрыв пробирку пробкой, петлю прожигают на огне, а пастеровскую пипетку опускают в банку с дезраствором (карболовой кислотой, лизолом, формалином и др.). Во время работы следят, чтобы среда не касалась пробки и не вылилась. Засеянные питательные среды помещают в термостат. При посеве на плотную среду пробирки с засеваемой (пересеваемой) культурой и со стерильной питательной средой (МПА) берут в наклонном положении (скошенная поверхность агара сверху) в левую руку, пробками в сторону пламени горелки. В открытую у пламени пробирку с культурой (или другим материалом) осторожно вводят петлю, слегка прикасаясь ею поверхности исследуемого материала, и, взяв небольшое количество (одну каплю), переносят его в другую пробирку со стерильной средой. Петлю опускают до дна пробирки, погружают в конденсационную жидкость и зигзагообразными движениями петлей проводят вверх по скошенной поверхности агаровой среды. При посеве уколом в плотную среду пробирку удерживают в горизонтальном положении. Посевы (пробирки) ставят в термостат для культивирования. Через 16...18, 24...48 ч учитывают результат и изучают культуральные свойства бактерий. В жидкой среде рост микроорганизмов проявляется либо в виде равномерного помутнения за счет увеличения числа бактериальных клеток, либо осадка (в этом случае среда остается прозрачной). Осадок может быть рыхлый, легко разбивающийся при встряхивании пробирки, или слизистый, поднимающийся в виде «косички», «смерчика*», а также в виде сплошной массы на дне пробирки или мелких крупинок, располагающихся на стекле пробирки. Некоторые виды микроорганизмов из-за повышенной потребности в кислороде воздуха растут на поверхности жидкой среды, образуя пленку и не вызывая помутнения бульона. Пленка может быть сухой и слизистой, гладкой и складчатой. В ряде случаев бактериальные культуры дают одновременно помутнение среды, обильный осадок и пристеночное кольцо на поверхности. На плотной среде культуральные свойства определяют по характеру развивающихся колоний. При внесении на поверхность среды большого числа бактериальных клеток наблюдают сплошной рост микробной массы. При высеве небольшого числа клеток на среду с большой поверхностью из каждой бактериальной клетки в результате ее деления (размножения) формируется колония. В зависимости от диаметра колонии могут быть крупные (более 2 мм), мелкие (1...2 мм), или совсем маленькие в виде мельчайших росинок. Различают колонии сухие, влажные (сочные) или слизистые; гладкие, глянцевые, шероховатые с неровной поверхностью, с ровными или не ровными краями, выпуклые, плоские и с углублением по середине, прозрачные и матовые, бесцветные или пигментированные. Колонии многих видов бактерий, актиномице-тов, плесневых грибов, дрожжей при росте на различных питательных субстратах могут принимать различную окраску, обусловленную выделением красящих веществ —пигментов. (Если пигменты растворимые, окрашивается вся среда, а если не растворимые, тогда окрашивается микробная масса колоний.) Для различных видов микроорганизмов характерно образование пигмента определенного цвета — сине-зеленого, золотистого, белого, кремового, лимонно-желтого, пурпурно-красного и др. Пигментооб-разование ярче выражено на плотных средах (картофель, молочный агар и др.). Для данного процесса имеет значение температурный уровень; оптимум для многих видов составляет 25...3СГС. Определенное влияние оказывают кислород воздуха и рассеянный свет. Особенности роста микроорганизмов на плотных и в жидких средах (культуральные признаки). Рост на плотной среде. Микроорганизмы, развиваясь на поверхности плотных сред, образуют характерные для данного вида колонии. Поэтому вид колоний — один из признаков, который необходим для идентификации исследуемого микроорганизма. При описании учитывают следующие признаки колоний: форму — округлая, амебовидная, ризоидная, неправильная и др.; размеры, диаметр (мм); если размеры колонии не превышают I мм, то такие колонии называют точечными; оптические свойства — прозрачная, полупрозрачная (просвечивает), непрозрачная, блестящая, матовая, флуоресцирующая; цвет — самой колонии и среды; поверхность — гладкая, шероховатая, складчатая, бугристая; профиль — плоский, выпуклый, кратерообразный, врастающий в агар и др.; край — ровный, волнистый, лопастной, ризоидный и др,; структуру — однородная, мелко- или крупнозернистая, струйчатая; консистенцию — маслянистая, тестообразная, вязкая, пленчатая; способность к эмульгированию — равномерная или зернистая суспензия в воде, слабо или совсем не суспендируется в воде. Край и структуру колонии определяют при малом увеличении микроскопа; чашку Петри в этом случае помещают на столик микроскопа крышкой вниз (рис. 34...36). Консистенцию колонии устанавливают прикосновением к ее поверхности микробиологической петлей. При посеве клеток в толщу плотной питательной среды наряду с поверхностными колониями образуются глубинные и донные колонии. Глубинные колонии довольно однообразны и чаще всего имеют вид сплющенных чечевичек, лишь у немногих видов бактерий они напоминают клочки ваты из-за нитевидных выростов в толщу среды. Если микроорганизмы в процессе развития выделяют газы, обра Рис. 34. Формы колоний (вид сверху)         зование глубинных колоний сопровождается разрывом плотной среды. Еще менее характерны донные колонии, образующиеся при соприкосновении агаризованной среды с дном чашки Петри. Эти колонии обычно имеют вид довольно крупных бесцветных прозрачных налетов. Описание колонии часто дополняют характером роста микроорганизмов по штриху на поверхности скошенной плотной питательной среды. При этом отмечают его интенсивность — скудный, умеренный, обильный и особенности — налет сплошной с ровным или волнистым краем, четко видный в виде цепочки изолированных колоний, диффузный, перистый, древовидный или ризоид Рис. 35. Формы колоний (вид сбоку)  ный. Отмечают оптические свойства штриха, его цвет, поверхность и консистенцию. При описании колонии и роста микроорганизмов по штриху обязательно указывают состав среды и возраст культуры, так как колонии одного и того же микроорганизма на различных средах могут отличаться рядом признаков. В определителях обычно приведены описания колоний и роста микроорганизмов по штриху только на мясопептонном агаре или на мясо-пептонном агаре и мясопептонной желатине. Рост на картофеле. Многие микроорганизмы растут на ломтиках картофеля и образуют налеты, характерные для представителей данного вида. Особенность роста на картофеле является диагностическим признаком и играет определенную роль при идентификаций. Ломтики картофеля подготавливают в качестве среды следующим образом. Клубни тщательно моют водой, очищают от кожуры и пробочным сверлом вырезают кусочки в форме цилиндра длиной 4...5 см. Цилиндры разрезают по диагонали (на клинья) и для нейтрализации клеточного сока погружают на 1 ч в 1%-й раствор гидрокарбоната натрия (NaHCO3) или скошенную поверхность картофеля натирают мелом. После этого кусочки картофеля помеща ют в пробирки, на дно которых предварительно положена вата, смоченная водой. Стерилизуют картофель при 50кПа.  Рис. 36. Края колоний (вид под микроскопом) Посев делают петлей, втирая посевной материал в скошенную поверхность картофеля. Отмечают рост микроорганизмов или его отсутствие. Если рост есть, то указывают его интенсивность и характерные особенности, используя те же признаки, что и при описании роста па плотных средах. Особое внимание обращают на образование пигмента. Рост в жидкой среде. Рост микроорганизмов в жидких питательных средах при стационарных условиях культивирования характеризуется большим единообразием по сравнению с ростом на плотных средах. Он сопровождается помутнением среды, образованием пленки или осадка. Отмечая особенности роста в жидких средах, указывают прежде всего его интенсивность: скудный, умеренный или обильный. Помутнение среды может быть однородным, хлопьевидным или с шелковистой волнистостью. Если образуется пленка, указывают ее особенности: кольцеобразная или сплошная, тонкая или толстая, плотная или рыхлая, гладкая или складчатая, сухая или слизистая, всползающая или опадающая. При образовании осадка характеризуют его свойства: скудный или обильный, рыхлый, плотный, хлопьевидный, зернистый или слизистый. Обычно для того чтобы охарактеризовать рост в жидкой среде, используют МПБ. Если изучаемый микроорганизм не растет в МПБ, то подбирают такую жидкую среду, которая подходит для него. Рост в МПБ и в жидких средах описывают, используя 4...7-суточные культуры, выращенные в стационарных условиях. |
Похожие:
 |
Плюс Утверждены Министерством сельского хозяйства Российской Федерации... Казань, Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии, Дагестанского научно-исследовательского... |
|
Правила проведения дезинфекции и дезинвазии объектов государственного ветеринарного надзора Казань, Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии, Дагестанского научно-исследовательского... |
 |
Правила проведения дезинфекции и дезинвазии объектов государственного ветеринарного надзора Казань, Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии, Дагестанского научно-исследовательского... |
|
№4: «Детоксикационная терапия в ветеринарной медицине» Цель: Изучить отравления, наиболее часто встречающиеся в ветеринарной практике, и научится применять методы их детоксикации |
|
Бакалавра Работа выполнена на кафедре микробиологии спбгу научный... Выявление представителей рода Mycobacterium в аквариумной воде, находящейся в замкнутой системе очистки |
|
Отчёт по ветеринарно-санитарной экспертизе о прохождении производственной практики «Приложение». Глвсэ является подразделением Государственной ветеринарной службы и подчинена районной ветеринарной лаборатории, находящейся... |
|
Исследования в ветеринарной офтальмологии Шиотца и электронный аппланационный тонометр Tonopen; в российской ветеринарной практике наиболее часто применяют механический аппланационный... |
|
Инструкция №29/13-и по применению дезинфицирующего средства «хорт таблетки» «Республиканский центр гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья» (гу «рцгэиОЗ» мз республики Беларусь); Государственное учреждение... |
|
Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н. Э. Баумана часть 1 Казань 2015 Материалы международной научной конференции студентов, аспирантов и учащейся молодежи, посвященной 85-летию зоотехнического образования... |
|
Тезисы докладов 68 научно-практической конференции студентов, аспирантов... Печатается по решению Ученого совета факультета ветеринарной медицины и факультета биотехнологии и стандартизации фгбоу впо «Казанская... |
|
Практикум Федеральное агентство по образованию рв владивостокский государственный университет Практикум «Английский язык: Читаем и говорим по-английски. Часть 2» предназначен для студентов специальностей «Международные отношения»... |
|
Практикум Министерство образования и науки Российской Федерации Владивостокский... Практикум по дисциплине «Маркетинг» предназначен для проведения практических занятий и организации самостоятельной работы студенты... |
|
Практикум ю. А. Медведев Министерство образования и науки Российской... Информационные технологии в математике: Практикум / Владим гос пед ун-т. Владимир, 2005. 96 с |
|
Учебное пособие к лабораторным занятиям по фармацевтической химии... Методическое пособие «Анализ органических лекарственных веществ» предназначено для проведения лабораторно-практических занятий у... |
|
Римское право практикум Игнатенко А. В., Чорновол Е. П. Римское право: Учебное пособие. Практикум. Екатеринбург: Изд-во Уральской академии государственной... |
|
Е. В. Ежова практикум по уголовному праву Практикум по уголовному праву. Особенная часть: Учебное пособие для студентов заочного отделения. Уфа: риц башГУ, 2013. –81 с |