Результаты опыта оценивают по наличию или отсутствию роста микроорганизмов в жидкой и на твердой питательной среде. Сравнение проводят с контролем опыта, которым является посев тест-микроорганизмов в питательную среду без добавления ДС или субстанции.
Эффективной считают концентрацию средства, при которой трижды повторенный опыт при определенном времени воздействия дает отрицательный результат (отсутствие роста микроорганизмов) при наличии типичного роста тест-культуры в контроле.
5.1.2.2. Метод батистовых тест-объектов
Подготовка батистовых тест-объектов.
Перед приготовлением батистовых тест-объектов кусок батиста погружают на 24 ч в холодную воду для удаления аплитуры, крахмала. Затем его тщательно стирают с мылом, кипятят, сушат и гладят утюгом. С помощью иглы в приготовленном куске ткани выдергивают нитки в продольном направлении на расстоянии 11 мм друг от друга, а в поперечном - на расстоянии 6 мм. По этим линиям батист разрезают ножницами на тест-объекты и по 50 штук раскладывают в чашки Петри, последние заворачивают в бумагу и стерилизуют паровым методом при 132 °C (2,0 кГс/кв. см) 20 мин.
Контаминация батистовых тест-объектов.
Приготовление суспензии тест-микроорганизмов (E. coli, S. aureus, P. aeruginosa, S. typhimurium) проводят в соответствии с п. 5.1.1.1. Для контаминации стерильные батистовые тест-объекты в чашке Петри заливают суспензией тест-микроорганизма из расчета 0,5 мл на 1 тест-объект, равномерно смачивая все тест-объекты. Чашку Петри закрывают крышкой и оставляют на 20 мин. Затем в асептических условиях батистовые тест-объекты, пропитанные суспензией тест-микроорганизмов, переносят на поверхность стерильной фильтровальной бумаги (2 - 4 слоя на дне чашки Петри), прикрывают их сверху стерильной фильтровальной бумагой и закрывают чашку Петри крышкой. Через 10 мин. после удаления избытка жидкости тест-объекты переносят на поверхность сухой стерильной фильтровальной бумаги в чашке Петри и сверху прикрывают стерильным листом фильтровальной бумаги, подсушивают в термостате при 37 °C в течение 20 мин. с приоткрытой крышкой.
Хранят контаминированные батистовые тест-объекты в чашках Петри в холодильнике при температуре 4 °C.
Срок хранения тест-объектов: контаминированных E. coli, S. typhimurium, P. aeruginosa - 1 сутки, S. aureus - 4 суток.
Постановка опыта. При постановке опытов в стерильную пробирку пипеткой наливают требуемый объем приготовленного дезинфицирующего раствора (из расчета 0,5 мл на каждый тест-объект) и, не касаясь краев колбы, опускают в него с помощью стерильного пинцета все тест-объекты, используемые в эксперименте (по 2 на каждую экспозицию). Легким покачиванием колбы достигают смачивания тест-объектов исследуемым раствором. Колбу помещают в водяную баню с температурой 18 - 20 °C и поддерживают данную температуру в течение всего эксперимента. При постоянной температуре в помещении 18 - 20 °C эксперименты можно проводить без использования водяной бани.
Отсчет времени воздействия эталонного раствора начинают с момента смачивания всех тест-объектов раствором. Через определенные интервалы времени (5 мин.) стерильным пинцетом или платиновой петлей извлекают по 2 тест-объекта из раствора и погружают в пробирки с 5 мл стерильного раствора соответствующего нейтрализатора. Через 5 мин. тест-объекты переносят в пробирку со стерильной питьевой водой, а еще через 5 мин. каждый из двух тест-объектов в отдельности переносят в пробирки с жидкой питательной средой, необходимой для культивирования изучаемого тест-микроорганизма.
Контролем являются 2 тест-объекта, погруженные на весь период эксперимента в раствор нейтрализатора, и 2 тест-объекта, погруженные на этот же срок в питьевую воду, которые по окончании эксперимента переносят в питательную среду. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37 °C. Результаты оценивают качественно по отсутствию/наличию роста тест-микроорганизма в питательном бульоне.
Критерием активности ДС и субстанций является 100% гибель тест-микроорганизмов (отсутствие роста в опытных пробах) при времени дезинфекционной выдержки S. aureus, E. coli, S. typhimurium, P. aeruginosa - не более 30 мин.
5.1.2.3. Методы исключения бактериостатического
действия действующих веществ
Для определения микробоцидного и исключения бактериостатического действия ДВ по истечении экспозиции необходимо прекратить воздействие ДВ на тест-культуру. Это достигается путем использования следующих методов:
- применения химического нейтрализатора;
- посева в большой объем питательной среды;
- ежедневного пересева на новые питательные среды;
- биологической пробы на животных.
Применение химического нейтрализатора действующего вещества.
Для нейтрализации действующего вещества, которое может быть перенесено с материалом тест-объекта при его посеве в питательную среду, используют нейтрализатор - вещество, которое устраняет, нейтрализует действие химического агента на микробную клетку, но не убивает и не задерживает рост тест-микроорганизма. Тест-объекты после воздействия химического агента промывают в нейтрализаторе или добавляют его непосредственно в питательную среду (если установлено, что вносимая концентрация нейтрализатора не убивает и не задерживает рост тест-бактерий).
В качестве нейтрализаторов ДВ из различных химических групп применяют для:
- галоидактивных (хлор-, бром- и йодактивные) и кислородактивных (перекись водорода, ее комплексы с солями, надуксусная кислота, озон) - 0,1 - 1,0%-ные растворы тиосульфата натрия;
- четвертичных аммониевых солей (алкилдиметилбензиламмоний хлорид, дидецилдиметиламмоний хлорид и др.), производных гуанидина (полигексаметиленгуанидин гидрохлорид, хлоргексидин биглюконат и др.) - 0,1 - 1,0%-ные растворы лаурилсульфата натрия (сульфонол) или растворы лаурилсульфата натрия с 10% обезжиренного молока или универсальный нейтрализатор (см. ниже);
- альдегидов (глутаровый альдегид, глиоксаль, формальдегид, ортофталевый альдегид) - 1,0%-ный раствор пиросульфита (метабисульфита) натрия или универсальный нейтрализатор (см. ниже);
- кислот - щелочи в эквивалентном количестве;
- щелочей - кислоты в эквивалентном количестве;
- спиртов - разведение в воде до недействующей концентрации;
- композиционных средств - универсальный нейтрализатор, содержащий Твин-80 (3%), сапонин (0,3 - 3,0%), гистидин (0,1%), цистеин (0,1%). Если в состав композиции входят окислители, в нейтрализатор дополнительно вводят тиосульфат натрия.
Методика контроля полноты нейтрализации действующего вещества с использованием культуры бактерий. В целях сокращения времени на подбор оптимального нейтрализатора, а также объективного подтверждения того, что ДВ, входящие в состав субстанции или ДС, полностью нейтрализованы, используют культуру бактерий, чувствительную к исследуемому ДВ, например тест-штамм E. coli (штамм 1257) или S. aureus (штамм 906), выращенные, как описано в п. 5.1.1.
Поэтому каждый случай проведения испытания ДС должен предварительно сопровождаться экспериментальным контролем эффективности нейтрализации остаточного действия ДС на микробную клетку, а также на бактерицидное и бактериостатическое действие используемой концентрации нейтрализатора.
Для контроля эффективности нейтрализатора и полноты нейтрализации ДС используют суспензионный метод, предусматривающий проведение исследования, основные операции которого и их назначение приведены на схеме 5.1 (не приводится) и в табл. 5.2.
Таблица 5.2
НАЗНАЧЕНИЕ ОПЕРАЦИЙ ЭКСПЕРИМЕНТА ПО ОЦЕНКЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ
НЕЙТРАЛИЗАЦИИ ОСТАТОЧНОГО ДЕЙСТВИЯ ДС
┌─────┬─────────────────┬─────────────────────────────────┬───────────────┐
│ N │ Назначение │ Процедура выполнения операции │ Ожидаемый │
│пробы│ операции │ исследования │ результат │
│ │ исследования │ │ │
├─────┼─────────────────┼─────────────────────────────────┼───────────────┤
│1 │Контроль │К 9 мл суспензии тест-культуры │Рост │
│ │губительного │ 3 │микроорганизмов│
│ │действия ДС │(10 КОЕ/мл) на дист. воде + 1 мл│должен │
│ │ │раствора ДС │отсутствовать │
├─────┼─────────────────┼─────────────────────────────────┼───────────────┤
│2 │Контроль полноты │К 9 мл суспензии тест-культуры │Примерно │
│ │нейтрализации ДС │ 3 │одинаковое │
│ │ │(10 КОЕ/мл) на нейтрализаторе + │количество │
│ │ │1 мл раствора ДС │колоний в │
├─────┼─────────────────┼─────────────────────────────────┤посевах проб по│
│3 │Контроль отсут- │К 9 мл суспензии тест-культуры │0,1 мл на │
│ │ствия антимикроб-│ 3 │плотной │
│ │ного эффекта у │(10 КОЕ/мл) на нейтрализаторе + │питательной │
│ │нейтрализатора │1 мл раствора нейтрализатора │среде │
├─────┼─────────────────┼─────────────────────────────────┤ │
│4 │Референс-контроль│К 9 мл суспензии тест-культуры │ │
│ │количества бак- │ 3 │ │
│ │терий (E. coli) │(10 КОЕ/мл) на д.в.+ 1 мл дист. │ │
│ │ │воды │ │
├─────┴─────────────────┴─────────────────────────────────┴───────────────┤
│ Примечание: спустя 5 мин. после постановки опыта из каждой из четырех│
│проб производят посев смеси по 0,1 мл как минимум на 3 пробирки со│
│скошенной питательной средой, которые инкубируют в термостате при 37 °C,│
│по истечении 2 - 3 суток учитывают результаты исследований. │
└─────────────────────────────────────────────────────────────────────────┘
Критерии отбора действующих веществ (субстанций). Критерием отбора действующего вещества в качестве субстанции для создания ДС является наличие у него бактерицидной активности.
Гибель тест-микроорганизмов должна составлять 100% при времени действия мин. ДС в минимальной концентрации в отношении бактерий (S. aureus, E. coli, S. typhimurium, P. aeruginosa) не более 30 мин.
5.1.2.4. Методы изучения факторов, влияющих
на бактерицидную активность ДС и их субстанций
Исследования включают определение спектра антимикробного действия ДС, а при проведении углубленного изучения - дополнительно влияние различных факторов (pH, температура, органические вещества) на антимикробную активность растворов ДС. Такая необходимость возникает при изучении ДС, созданных на основе нового, ранее не изученного ДВ.
Изучение спектра антимикробной активности и влияние на активность различных факторов проводят методом батистовых тест-объектов (п. 5.1.2.2), контаминированных тест-микроорганизмами.
Изучение зависимости активности ДС от присутствия органических веществ проводят при добавлении к суспензии микроорганизмов 20% инактивированной лошадиной сыворотки или сыворотки крупного рогатого скота при контаминации батистовых тест-объектов.
Для инактивации нормальной сыворотки ее прогревают на водяной бане при температуре плюс 56 °C в течение 30 мин.
Испытание бактерицидной активности ДС в присутствии органических веществ проводят с теми концентрациями, которые оказались эффективными при обеззараживании тест-объектов, контаминированных тест-микроорганизмами без добавления сыворотки.
Если активность средства при таких условиях эксперимента не снижается, концентрацию сыворотки увеличивают до 40%. При отсутствии снижения активности ДС и при добавлении 40% белка считают, что в присутствии белка активность средства не снижается.
Влияние температуры на активность исследуемого ДС изучают при обеззараживании контаминированных батистовых тест-объектов растворами средств при различных температурах растворов (от -30 до 50 °C). Для этого колбу с исследуемым раствором ДС помещают в водяную баню или холодильную камеру и устанавливают необходимую температуру. Температуру раствора доводят до желаемого уровня и опускают в него контаминированные тест-микроорганизмами батистовые тест-объекты. Далее порядок проведения опыта такой, как при изучении спектра антимикробного действия субстанций (п. 5.1.2.2). Температуру поддерживают в течение заданной экспозиции. Если эффективная концентрация одинаковая при температуре растворов 18 - 20 °C и других значениях, то считают, что температура не влияет на активность ДС и, соответственно, если эффективная концентрация увеличивается или уменьшается, то считают, что с повышением или понижением температуры эффективность ДС снижается или повышается.
Влияние pH среды на активность исследуемого ДС изучают при обеззараживании контаминированных тест-микроорганизмами батистовых тест-объектов в растворах ДС, имеющих различное значение pH (5,6 - 6,0; 7,0; 8,5 - 9,0). Готовят ряд разведений исследуемого вещества, искусственно подкисляя или подщелачивая растворы. Для подкисления используют децинормальный раствор соляной или другой кислоты, а для подщелачивания - децинормальный раствор щелочи. Порядок проведения опыта такой же, как при оценке спектра антимикробного действия субстанций, п. 5.1.2.2.
Влияние факторов среды на активность ДС учитывается при разработке оптимальных режимов и применении ДС в практике.
5.1.3. Методы исследования бактерицидной эффективности ДС,
предназначенных для обеззараживания объектов внешней среды,
контаминированных тест-микроорганизмами
Цель исследования - разработка режимов применения ДС с учетом условий их дальнейшего применения на практике для обеззараживания изделий медицинского назначения ИМН, предметов ухода за больными, игрушек, белья, поверхностей, посуды, выделений и т.п. в зависимости от вида контаминации, концентрации действующего вещества, времени воздействия, нормы расхода, характера объекта, наличия на нем органического загрязнения и его специфики, температуры, способа и кратности обработки.
5.1.3.1. Исследование бактерицидной эффективности ДС,
предназначенных для обеззараживания ИМН
При выборе ДС для исследований с указанной целью следует учитывать:
- назначение и кратность применения ИМН (многократного или однократного применения);
- наличие у ДС негативных свойств, например корродирующего или фиксирующего действия и т.п., ограничивающих возможности его использования или требующих индивидуального методического подхода при исследовании;
- материал (материалы), из которого изготовлено ИМН;
- функциональные особенности изделия и условия его эксплуатации, обусловливающие особенности методики проведения эксперимента и последующих рекомендаций по технологии их обеззараживания.
Исследование эффективности ДС, предназначенных для обеззараживания ИМН из различных материалов (кроме эндоскопов). В качестве тест-изделий используют стерильные инструменты и ИМН (катетеры, микропипетки, пластмассовые шпатели и др.) из различных материалов (металлов, резин, стекла, пластмасс) или имитирующие их тест-объекты. Перечень инструментов, взятых в эксперимент, должен включать не менее трех инструментов, имеющих замковые части (щипцы, ножницы, корнцанг), и не менее двух, не имеющих замковых частей (пинцеты, шпатели), а также стоматологические, в т.ч. вращающиеся, инструменты (не менее 4) - бор, бурав корневой, зеркало, диск шлифовальный. В качестве тест-изделий из резин, стекла, пластмасс используют фрагменты изделий катетеров, микропипеток, шпателей и пр.
В качестве тест-микроорганизмов используют S. aureus, P. aeruginosa. На поверхность тест-изделия (у замковых ИМН - в область замка, а при наличии каналов и полостей - также в канал изделия) с помощью пипетки наносят по 0,1 мл 1-млрд. суспензии того или иного вида тест-микроорганизмов, содержащей 40% инактивированной лошадиной сыворотки. Тест-изделия подсушивают до полного высыхания. Мелкие тест-изделия погружают в указанную взвесь тест-микроорганизмов на 15 мин., затем их извлекают и подсушивают (до полного высыхания). При испытании ДС, обладающих фиксирующими свойствами, количество добавляемой сыворотки уменьшают до 5%.
Дезинфицирующие растворы готовят на стерильной питьевой воде. После подсушивания контаминированные изделия полностью погружают в раствор испытываемого ДС, заполняя им все каналы и полости изделий, избегая образования воздушных пробок. Инструменты, имеющие замковые части, погружают раскрытыми, предварительно сделав ими в растворе ДС несколько рабочих движений для лучшего проникновения раствора в труднодоступные участки изделий в области замка. Толщина слоя раствора ДС над изделиями должна быть не менее 1 см. Параллельно для контроля изделия погружают в воду.
|
