Методические указания к практическим занятиям по энзимологии 2012 для студентов факультета биоинженерии и биоинформатики мгу им. М. В. Ломоносова

Скачать 0.68 Mb.

Название	Методические указания к практическим занятиям по энзимологии 2012 для студентов факультета биоинженерии и биоинформатики мгу им. М. В. Ломоносова
страница	1/5
Тип	Методические указания

rykovodstvo.ru > Руководство эксплуатация > Методические указания

1 2 3 4 5

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К ПРАКТИЧЕСКИМ ЗАНЯТИЯМ ПО ЭНЗИМОЛОГИИ
2012

ДЛЯ СТУДЕНТОВ ФАКУЛЬТЕТА БИОИНЖЕНЕРИИ И БИОИНФОРМАТИКИ МГУ ИМ. М.В. ЛОМОНОСОВА

ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ВЫДЕЛЕНИЯ

И ХРАНЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ 3

Методы очистки ферментов 3

Экстракция 3 Кислотная обработка 3

Термическая обработка 3

Фракционирование солями 3

Фракционирование органическими растворителями 4

Хроматографирование белков на колонках 4

Ионообменная хроматография 4

Подготовка ионообменных адсорбентов к работе 4

Ионообменники на целлюлозной основе 5

Ионообменникам на основе сефадекса 5

Уравновешивание ионообменников 5

Заполнение колонки 5

Нанесение образца на колонку 5

Элюция белка с колонки 5

Регенерация 5

Гель-хроматография 6

Концентрирование растворов

высокомолекулярных соединений 6

Техника работы с сефадексом 6

Подготовка сефадекса к работе 6

Заполнение колонки 6

Нанесение образца на колонку 7

Элюция 7

Многократное использование сефадекса и его хранение 7

Последовательность использования

различных методов фракционирования для

очистки фермента 7

Критерий чистоты препаратов ферментов 7

Электрофорез белков в ПААГ 7

Электрофоретическое определение

молекулярной массы белков 7

Хранение ферментов 9

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И

ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

НЕКОТОРЫХ ФЕРМЕНТОВ 9

Фруктозодифосфатальдолаза из мышц кролика 9

Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа

из мышц кролика 10

Лактатдегидрогеназа из мышц кролика 11

Пируваткиназа из мышц кролика 12

ПРИЛОЖЕНИЯ 13

Значения pK_α и рабочие диапазоны рН буферных растворов 13

Приготовление буферных растворов 14

Приготовление сульфата аммония 14

Синтез 3-фосфоглицеринового альдегида (3-ФГА)

из фруктозо-6-фосфата 16

Определение концентрации белка 16

Выражение активности фермента 18

Измерение активности ферментов 19

Потенциометрический метод определения рН 20

Написание отчета по биохимическому практикуму 21

Рекомендуемая литература 22

ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ХРАНЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ
В живом организме содержится множество ферментов, которые находятся в виде сложных смесей и комплексов с веществами белковой и небелковой природы. Для изучения структуры ферментов, механизмов их действия, кинетических параметров и т.д. их необходимо выделить в чистом виде.

Выделение фермента начинают с экстракции его из ткани. В исходных экстрактах фермент обычно достаточно стабилен, т.к. там содержится множество различных белков. На последующих стадиях очистки стабильность фермента понижается. Поэтому важно очистку проводить достаточно быстро. Особенно это важно на тех стадиях, где фермент подвергается жестким воздействиям, например при фракционировании органическими растворителями.

Ферменты обычно инактивируются при рН ниже 5 и выше 9, по этой причине величину водородного показателя среды при выделении необходимо контролировать.

Реактивы, использующиеся при выделении, должны быть чистыми. Используют бидистиллированную воду, посуду без остатков детергента (для этого посуду после детергента следует ополаскивать 20 раз водопроводной водой и затем 3 раза дистиллированной водой).

На разных стадиях выделения и очистки ферментов (фракционирование солями, тепловая стадия и т.д.) необходимо постоянное перемешивание ферментного раствора. Не следует допускать, чтобы раствор вспенивался, т.к. на поверхности раздела сред ферменты денатурируются.

При фракционировании солями может происходить интенсивное выделение пузырьков воздуха. Поэтому кристаллы соли должны быть очень мелкими (соль предварительно измельчают в ступке). Добавлять соль следует небольшими порциями. Переливать раствор из сосуда в сосуд следует медленно, по стенке сосуда.

Осадки, образовавшиеся после фракционирования, отделяют при помощи центрифуги с охлаждением. Всегда следует стремиться к получению осадков максимальной плотности. Значительно увеличивается эффективность фракционирования, если выделяемый фермент находится в осадке, и повышается общий его выход, если он находится в растворе. При выделении ферментов в осадок на стадии фракционирования органическими растворителями преимущество получения плотных осадков заключается в том, что с помощью небольших объемов воды или буфера можно быстро снизить концентрацию растворителя до относительно безвредных величин.

Если фермент находится в неблагоприятных условиях, например, при отделении осадка, полученного в результате добавления органического растворителя, то увеличение времени центрифугирования нежелательно.

Для отделения осадков (кроме фракционирования с органическими растворителями) можно пользоваться складчатым фильтром.

При выделении на разных стадиях необходимо достаточно быстро определять активность, для определения степени очистки белка, активность следует выражать в единицах удельной активности, т.е. в единицах активности на 1 мг белка.

Также необходимо на различных стадиях быстро измерять концентрацию белка. Для этой цели наиболее подходящим является спектрофотометрический метод, а также используется метод Брэдфорд.

В некоторых случаях трудно рассчитать активность в исходном экстракте, т.к. интенсивно протекают побочные реакции. В таком случае, выход фермента в процентах и степень его очистки рассчитывают по отношению ко второй фракции.

Методы очистки ферментов.

Экстракция. Прежде чем проводить очистку фермента его необходимо извлечь из клетки, т.е. разрушить клеточную оболочку. Животную ткань разрушают с помощью гомогенизатора с металлическими ножами.

Можно разрушать клеточную оболочку, обрабатывая ткань ацетоном. Ткань животного помещают в гомогенизатор, заливают несколькими объемами ацетона и гомогенизируют в течение 1-2 мин. Так как ацетон сильно инактивирует ферменты (особенно при высокой температуре), то его предварительно охлаждают до -15^оС. Все процедуры проводят на холоду. Полученный гомогенат быстро фильтруют на воронке с отсасыванием. Осадок еще раз обрабатывают ацетоном, снимают с фильтра, измельчают руками при комнатной температуре, чтобы дать возможность испариться основной части ацетона, помещают в вакуумный эксикатор. Обработка ацетоном разрушает клеточную оболочку, обезвоживает ткань и освобождает ее в значительной степени от липидов. Ацетоновые порошки могут храниться в эксикаторе при 0^оС в течение нескольких месяцев.

При выделении из дрожжей, их вначале необходимо высушить. Высушенные дрожжи хранят при +4^оС в герметичной упаковке.

Для экстракции фермента из ткани используют соответствующий буфер.

При работе с активно гликолизирующими тканями, например, мышечной, экстракцию иногда проводят со слабыми растворами щелочи.

Если фермент подвержен действию тяжелых металлов, то экстракцию и всю последующую очистку проводят в присутствии ЭДТА.

Тканевой экстракт содержит множество белков, помимо требуемого. Их удаляют, используя различные методы фракционирования, сущность которых заключается в том, что при различных условиях (концентрации солей, органических растворителей и т.д.) различные белки характеризуются неодинаковой растворимостью.

Обычно при выделении белка применяют несколько методов фракционирования. На первых стадиях очистки целесообразно использовать методы, в которых учтены характерные особенности выделяемого фермента. Например, если он термостабилен, то проводят термическую обработку, таким образом, в самом начале избавляются от большинства термолабильных белков.

Обычно белки неустойчивы в кислой среде, поэтому если фермент выдерживает сильное подкисление, то именно с такой обработки целесообразно начинать его очистку.

Кислотная обработка. Добавляют раствор соответствующего буфера или кислоты (щелочи) для доведения до требуемого рН. Добавление кислоты (щелочи) производят на холоду, по каплям, при энергичном помешивании. При фракционировании белков подкисление используется как для осаждения нужного фермента, так и для осаждения балластных белков.Термическая обработка. Температура денатурации различных белков отличается друг от друга. Тепловую обработку проводят в сосуде, опущенном в водный термостат. Для равномерного нагревания требуется энергичное помешивание. Сразу по окончании термической обработки ферментный раствор быстро охлаждают, помещая его в лед. Необходимо интенсивно перемешивать раствор пока он не охладится.

Фракционирование солями. Различные белки выпадают в осадок при разной концентрации соли в растворе. Постепенно повышая концентрацию можно получить ряд отдельных фракций с преимущественным содержанием выделяемого фермента в одной из них.

В основном используют сульфат аммония, он хорошо растворим в воде и не разрушает ферменты.

Если нежелательно увеличение объема, сульфат аммония добавляют в сухом виде, небольшими порциями при помешивании. Сульфат аммония должен быть предварительно измельчен в ступке. Также используют насыщенный раствор сульфата аммония, особенно на последних стадиях очистки. В данном случае, преимущество его в том, что насыщенный раствор можно предварительно довести до нужного значения рН, и тогда в процессе его добавления не будет происходить закисления.

После растворения последней порции добавленной соли раствор следует перемешивать еще 15 минут для четкого разделения фракций.

Осадки после обработки сульфатом аммония удаляют центрифугированием или фильтрованием. При этом следует помнить, что фильтрующие средства могут адсорбировать какое-то количество исследуемого фермента, поэтому не рекомендуется работать с малыми объемами.

С повышением концентрации соли растворимость фермента понижается. При применении сульфата аммония фермент обычно практически полностью выпадает в осадок при дальнейшем увеличении степени насыщения раствора на 5-10%.

Концентрация соли, при которой фермент выпадает в осадок, непостоянна и зависит от ряда факторов, в частности от наличия сопутствующих веществ и содержания самого фермента в растворе. Также на это влияет природа соли, величина рН и температура.

Концентрацию сульфата аммония в растворе обычно выражают десятичной дробью, принимая полное насыщение за 1,0, или в процентах насыщения. Хотя, как правило, фракционирование проводят на холоде, за 100%-ное насыщение принимают насыщение при комнатной температуре. Определение активности отдельных сульфат – аммонийных фракций проводят только после того, как фракция выделена в осадок, а затем растворена в буфере. Для более точного измерения сульфат аммония следует удалить из ферментного раствора методом гельфильтрации или с помощью диализа.

Фракционирование органическими растворителями. Большинство ферментов быстро денатурируют при их обработке органическими растворителями при комнатной температуре. Поэтому фракционирование проводят при низких температурах, при этом, кроме прочего, усиливается осаждающее действие. На осаждение влияет присутствие солей (их не должно быть много), рН среды (оптимально около 6), оптимальная исходная концентрация белка – 5-20 мг/мл.

Для доведения до низкой температуры используют ацетоновую или спиртовую баню, добавляют сухой лед небольшими кусочками.

Температуру в бане доводят до -2 - -5^оС. Ферментный раствор наливают в стакан, помещают в баню и сразу же ставят на перемешивание. Как только температура ферментного раствора достигнет 0^оС, начинают добавлять охлажденный органический растворитель из делительной воронки – тонкой струйкой, по стенке. Температуру необходимо понижать плавно. Надо отметить, что при добавлении органического растворителя к ферментному раствору происходит разогревание смеси. По этой причине необходимо следить за тем, чтобы раствор в стакане не нагревался выше 0^оС. По мере добавления растворителя температура замерзания смеси в стакане понижается, и становится возможным вести работу при более низких температурах. Это осуществляется с помощью добавления в баню нескольких кусочков сухого льда. В процессе фракционирования температуру постепенно понижают, пока она не достигнет требуемой по методике величины.

После добавления необходимого количества органического растворителя рекомендуется продолжать перемешивание еще 15-20 мин при температуре фракционирования. Образующиеся осадки центрифугируют при той же температуре.

После центрифугирования осадок (если в нем наблюдается активность) сразу же растворяют в буфере. Растворитель можно удалить с помощью диализа.

Время пребывания фермента в растворе, содержащем органический растворитель должно быть минимальным.
Хроматографирование белков на колонках.
Ионообменная хроматография.
Ионообменные сорбенты – практически нейтральные, нерастворимые в воде матрицы с положительно или отрицательно заряженными группами. Существуют анионообменные адсорбенты (аниониты) и катионообменные (катиониты).

Молекулы белка способны образовать множество ионных связей. Нанесенная на колонку смесь белков связывается с ионообменником в виде узкой полосы в верхней части колонки. Пропускается элюирующий раствор и белковые фракции разделяются в соответствии с величиной их коэффициентов распределения, т.е. степенью их взаимодействия с ионообменником.

Наиборее распространены два типа ионообменников – на целлюлозной основе и на основе геля (сефадекса или биогеля). Целлюлозные ионообменники и на основе сефадекса – относительно инертны по отношению к кислотам и щелочам, в то время как свойства ионообменников на основе биогеля изменяются при продолжительном их выдерживании в щелочи.

При изменении рН и концентрации соли в среде объем ионообменников на основе сефадекса или биогеля существенно меняется. Целлюлозные ионообменники более стабильны.

Ионообменники на основе сефадекса G-25 рекомендуется использовать при работе с белками с молекулярной массой менее 10000 и более 200000. Для разделения белков с молекулярной массой от 10000 до 200000 используют сефадекс G-50.

Функциональные группы ионообменников различаются по знаку заряда и по их силе – в качестве основания или кислоты. Наиболее сильные катиониты и аниониты – соответственно, сульфоэтил- и гуанидиноэтил-ионообменники. Фосфо-ионообменники характеризуются наличием двух кислых функциональных групп.

Сродство ионообменных сорбентов к белку и их емкость определяются концентрацией соли в среде и значением рН. В то же время емкость зависит не только от общего количества заряженных групп ионообменника, но и от их распределения на поверхности матрицы.

Так как белки – диполярные ионы, при соответствующих условиях они могут связываться как с катионитами, так и с анионитами. Однако зона стабильности большинства белков находится в диапазоне рН от 5 до 8. Поэтому хроматографирование кислых белков с рI ниже 5 обычно проводят на анионитах, а щелочных (с рI выше 8) – на катионитах, используя при этом соответствующие сорбенты: при рН = 9 и ниже – ДЭАЭ (диэтиламиноэтил), при рН 3,5 и выше – КМ (карбоксиметил)- ионообменники. Хроматографирование рН-стабильных белков можно проводить и за пределами указанной зоны рН. При низких значения рН (менее 3,5) могут быть использованы фосфо- или сульфоэтилцеллюлозы (с ними можно работать и при более высоких рН). При рН выше 9 можно использовать гуанидиноэтил-ионообменники.