2. Исследование острой токсичности
2.1. Внутрижелудочное и внутрипузырное введение
Определение показателей острой токсичности включало эксперименты на грызунах (мышах, крысах). Животные распределялись по группам случайным образом методом рандомизации. В качестве критериев приемлемости рандомизации считали отсутствие внешних признаков заболеваний и гомогенность групп по весу тела (± 20%).
В опытах на грызунах препарат вводили белым крысам и мышам обоего пола внутрижелудочно (через атравматичный металлический зонд) в возрастающих дозах (в пересчете на действующее вещество) по Литчфилду-Уилкоксону. Расчеты средних летальных доз проводили по В.Б. Прозоровскому (Фармакология и токсикология, 1978, № 4, с. 497–502). Контрольным животным таким же путем вводили дистиллированную воду в объеме, эквивалентном максимальной испытанной дозе препарата (6-10 повторных введений на протяжении 6 часов).
Кроме этого препарат вводили самкам белых крыс в полость мочевого пузыря (внутрипузырно). Для этого, соблюдая правила асептики и антисептики, катетер через уретру самки крысы вводили в мочевой пузырь, затем через катетер с помощью шприца в мочевой пузырь вводили препарат.
Для осуществления катетеризации мочевого пузыря крысу под легким эфирным наркозом иммобилизировали на спине. Процесс иммобилизации крысы на спине с окончанием действия эфирного наркоза всегда сопровождался актом мочеиспускания. Этот факт свидетельствует о том, что мочевой пузырь опорожнен и позволяет ввести в него определенный объем препарата. Во избежание инициации повторного рефлекторного мочеиспускания у крысы за счет раздражения терморецепторов стенки мочевого пузыря температура шприца, его содержимого и катетера с помощью термостата поддерживали на уровне температуры внутренних органов крысы – 37.0oС. Кроме того, во избежание раздражения механорецепторов стенки мочевого пузыря с инициацией повторного рефлекторного мочеиспускания использовали малый объем жидкости – 0,2 мл на 100 г массы тела крысы. Это связано с тем, что объем внутрипузырной жидкости 0,1 мл и объем мочевого пузыря при массе тела крысы 150 г соотносятся между собой как 1/7-1/5. Следовательно, заполнение пустого мочевого пузыря на 1/7-1/5 его объема жидкостью, имеющей температуру, равную температуре внутренних органов крысы, не будет инициировать рефлекторное мочеиспускание. Это предположение было подтверждено собственными наблюдениями: катетеризация мочевого пузыря у иммобилизованного на спине животного с введением жидкости в мочевой пузырь при соблюдении вышеописанных условий ни разу не сопровождалась рефлекторным актом мочеиспускания.
Сразу после введения через катетер стерильного физиологического раствора (контроль) или препарата в полость мочевого пузыря катетер извлекали из уретры, а животное освобождали от иммобилизации.
Подобную процедуру повторяли несколько раз на протяжении 6 часов.
Использовали как 0.4% водные растворы, так и специально приготовленные для изучения острой токсичности 1% растворы. Дозирование осуществляли на содержание активного компонента — индигокармин.
Животные наблюдались в течение 2 недель с начала эксперимента.
Через 2 недели все пережившие интоксикацию животные были умерщвлены (эвтаназия осуществлялась передозировкой эфира) и подвергнуты вскрытию. Было проведено макроскопическое описание и определение массовых коэффициентов внутренних органов.
2.1.1.Токсикометрия
При внутрижелудочном введении препарата крысам и мышам обоего пола летальности достичь не удалось. У мышей предельной была доза 2000 мг/кг или до 10 мл раствора на мышь. Если при дозировании на общую массу препарата принять 1 мл равным 1 г, то доза, не вызывающая летальности у мышей при в/ж введении, составит почти 500 мл/кг (г/кг).
У крыс предельной была доза почти 800 мг/кг или 20 мл раствора. При пересчете на общую массу препарата доза, не вызывающая летальности у крыс при в/ж введении, составит почти 100 мл/кг (г/кг).
При внутрипузырном введении максимальная доза, которую удалось ввести, составила почти 100 мг/кг (до 5 мл раствора). При пересчете на общую массу препарата доза, не вызывающая летальности у крыс при в/п введении, составляет почти 35 мл/кг (г/кг).
2.1.2. Течение острой интоксикации
При остром в/ж введении препарата в дозах 2000 мг/кг (в пересчете на действующее вещество) не было выявлено каких-либо заметных токсических эффектов ни у крыс, ни у мышей.
Половых различий в течении интоксикации не отмечалось.
Внутрипузырное введение препарата не сопровождалось развитием симптомов интоксикации. Подопытные животные не отличались от контрольных, которым в/п вводили физиологический раствор. У животных обеих групп наблюдались лишь признаки эфирного опьянения, связанного с наркозом.
Результаты измерения массы тела животных, переживших интоксикацию, представлены в таблицах 2.1.2.1 и 2.1.2.2.
Таблица 2.1.2.1
Влияние острого в/ж введения препарата на массу тела мышей, г
Время
наблюдения
|
Группы
|
Контроль
|
Индигокармин
|
M
|
F
|
M
|
F
|
Фон
|
19.9 ± 0.4
|
19.3 ± 0.2
|
19.7 ± 0.4
|
19.5 ± 0.3
|
2-й день
|
19.7 ± 0.3
|
19.4 ± 0.3
|
19.1 ± 0.4
|
18.7 ± 0.5
|
7-й день
|
20.3 ± 0.2
|
20.2 ± 0.3
|
19.9 ± 0.5
|
19.3 ± 0.4
|
14-й день
|
20.7 ± 0.5
|
20.9 ± 0.3
|
20.2 ± 0.1
|
19.9 ± 0.6
|
Таблица 2.1.2.2
Влияние острого в/ж введения препарата на массу тела крыс, г
Время
наблюдения
|
Группы
|
Контроль
|
Индигокармин
|
M
|
F
|
M
|
F
|
Фон
|
180.7±4.7
|
177.5±2.0
|
181.2±4.5
|
179.2±3.1
|
2-й день
|
180.2±3.6
|
179.0±3.0
|
176.6±3.5
|
173.1±3.2
|
7-й день
|
185.9±4.1
|
182.4±2.8
|
178.6±2.4
|
180.6±3.6
|
14-й день
|
191.9±4.3
|
189.1±3.8
|
187.0±3.6
|
187.5±3.5
|
Таблица 2.1.2.3
Влияние острого в/п введения препарата на массу тела самок крыс, г
Время
наблюдения
|
Группы
|
Контроль
|
Индигокармин
|
Фон
|
180.8±5.8
|
182.1±3.7
|
2-й день
|
175.9±4.6
|
172.8±3.8
|
7-й день
|
181.4±3.5
|
179.5±3.4
|
14-й день
|
189.6±4.0
|
190.1±3.9
|
Из приведенных данных видно, что на второй день наблюдалось незначительное снижение массы тела в опытных группах. Это легко объяснимо, если учесть, что в этот период животные этих групп потребляли меньше пищи и воды.
2.1.3. Данные вскрытия (некропсии)
Внешний осмотр мышей и крыс, забитых через 2 недели после начала опыта, не выявил каких-либо существенных отличий опытных животных от контрольных. Все животные нормального телосложения, средней упитанности.
Слизистые полости рта и язык бледные, чистые. Зубы сохранены. Выделения из естественных отверстий отсутствовали. Шерсть была блестящей, опрятного вида; очагов облысения не наблюдалось. Раздражений, эрозий, изъязвлений на коже не отмечалось. Видимые слизистые оболочки были бледными, блестящими, гладкими. Молочные железы самок без уплотнений на ощупь. Половые органы самцов правильно выражены.
При осмотре грудной и брюшной полостей выпота не обнаружено, нарушений в положении и размерах внутренних органов не отмечалось. Листки плевры, перикарда и брюшины были тонкими, блестящими, гладкими.
Подчелюстные лимфатические узлы и слюнные железы имели округлую или овальную форму, гладкую поверхность, слегка желтоватый или розоватый цвет.
Щитовидная железа плотно прилежала к гортани. Консистенция ее была умеренно плотной. Величина и форма отклонений от нормы не представляли. Поверхность разреза была однородной розоватой окраски.
Тимус имел треугольную форму, беловатый цвет и умеренно плотную консистенцию.
Диаметр аорты был равномерным на всем протяжении. Интима аорты была гладкой, блестящей, беловатой окраски.
Величина и форма сердца изменений не представляли. Мышца сердца была умеренно плотной, равномерно коричневатой окраски. Клапаны сердца были тонкими, гладкими, блестящими. В полостях сердца содержалось небольшое количество жидкой крови.
Легкие спадались при вскрытии грудной клетки. Величина и форма их изменений не представляли. Поверхность легких имела однородную бледно-розовую окраску. Ткань легких была пушистой на ощупь. Просвет трахеи и крупных бронхов был широким. Слизистая оболочка была блестящей, бледно-розовой, гладкой.
Слизистая пищевода была блестящей, гладкой, бледного цвета. Величина и форма желудка изменений не представляли. Его просвет был заполнен пищевым содержимым. Гиперемии, эрозий, кровоизлияний, свидетельствующих о раздражающем действии введенного препарата, не наблюдалось.
Просвет 12-перстной кишки изменений не представлял, слизистая кишки была блестящей, гладкой, бледно-розовой. Слизистая оболочка тонкой кишки была так же бледно-розовой, блестящей, гладкой. Слизистая оболочка толстой кишки имела слегка сероватый оттенок, была гладкой, блестящей.
Форма и величина печени изменений не представляли. Поверхность печени была гладкой, однородной темно-красной окраски. Ткань печени на разрезе была темно-красной. Капсула печени была тонкой, прозрачной. Консистенция печени имела обычную плотность.
Форма поджелудочной железы изменений не представляла. Железа имела дольчатое строение, бледно-розовую окраску и умеренно плотную консистенцию.
Размеры и форма селезенки изменений не представляли. Поверхность селезенки имела однородную темно-вишневую окраску, была гладкой. Консистенция селезенки была умеренно плотной. На разрезе органа выделялись сероватые мелкоклеточные фолликулы.
Величина и форма почек так же не представляли изменений. Капсула почек легко снималась. Поверхность была гладкой, однородно коричневато-сероватого цвета. На разрезе органа хорошо различимы корковое и мозговое вещество. Консистенция почек была умеренно плотной.
Надпочечники имели округлую форму, беловато-желтую окраску и умеренно плотную консистенцию. На разрезе отчетливо выделялось темно-коричневое мозговое вещество.
Мочевой пузырь был заполнен прозрачной, светлой мочой. Слизистая оболочка мочевого пузыря была гладкой, блестящей, бледной окраски, без признаков раздражения или воспаления.
Яичники имели неровную зернистую поверхность, темно-красный цвет и округлую форму. Тело матки было умеренно плотным, имело обычные размеры, темно-красный цвет. Яички самцов были умеренно плотными, беловатого цвета, обычных размеров.
Оболочки головного мозга были тонкими, прозрачными. Вещество мозга было чуть плотноватым на ощупь, поверхность мозга была гладкой. На фронтальных размерах расширения желудочков не наблюдалось.
Ниже, в таблицах 2.1.3.1 и 2.1.3.2, приведены массовые коэффициенты внутренних органов животных.
Данные, приведенные в таблицах, не показывают каких-либо достоверных отличий в величине массовых коэффициентов исследованных органов; сами значения коэффициентов соответствуют видовой норме.
Таблица 2.1.3.1
Массовые коэффициенты (МК, г/кг веса тела) органов белых
мышей при в/ж введении препарата через 2 недели после начала опыта
Орган
|
Группы
|
Контроль
|
Индигокармин
|
M
|
F
|
M
|
F
|
Сердце
|
3.9±0.1
|
3.7±0.1
|
3.9±0.1
|
3.5±0.1
|
Легкие с трахеей
|
6.3±0.2
|
6.1±0.2
|
7.0±0.2
|
6.5±0.2
|
Тимус
|
0.93±0.08
|
0.96±0.10
|
0.93±0.09
|
0.94±0.06
|
Печень
|
40.2±1.3
|
37.6±1.5
|
35.2±1.3
|
38.3±1.8
|
Селезенка
|
3.69±0.41
|
3.73±0.32
|
3.64±0.23
|
3.60±0.38
|
Почки
|
10.4±0.5
|
10.9±0.7
|
11.2±0.5
|
11.4±0.6
|
Надпочечники
|
0.15±0.03
|
0.12±0.03
|
0.15±0.02
|
0.10±0.02
|
Головной мозг
|
15.5±1.3
|
16.4±0.9
|
17.4±0.6
|
16.7±0.8
|
Яички или яичники
|
3.8±0.1
|
0.26±0.02
|
3.2±0.1
|
0.17±0.02
|
Таблица 2.1.3.2
Массовые коэффициенты (МК, г/кг веса тела) органов белых
крыс через 2 недели после начала опыта
Орган
|
Группы
|
Контроль
|
В/ж введение
|
В/п введение
|
M
|
F
|
M
|
F
|
F
|
Сердце
|
4.0±0.1
|
4.0±0.3
|
4.0±0.2
|
3.8±0.2
|
4.0±0.2
|
Легкие с трахеей
|
7.2±0.2
|
7.2±0.5
|
7.2±0.3
|
7.3±0.5
|
7.6±0.09
|
Тимус
|
1.33±0.13
|
1.35±0.09
|
1.35±0.12
|
1.27±0.08
|
1.26±0.13
|
Печень
|
38.4±1.5
|
39.3±1.6
|
37.9±1.3
|
38.2±1.8
|
39.5±1.9
|
Селезенка
|
4.1±0.07
|
3.9±0.09
|
3.8±0.08
|
3.8±0.1
|
3.8±0.1
|
Почки
|
4.2±0.2
|
4.1±0.3
|
4.3±0.09
|
4.6±0.08
|
4.7±0.09
|
Надпочечник (левый)
|
0.10±0.04
|
0.06±0.02
|
0.09±0.02
|
0.08±0.01
|
0.09±0.01
|
Головной мозг
|
8.7±0.2
|
8.6±0.3
|
9.0±0.2
|
8.7±0.1
|
9.0±0.2
|
Яички или яичники
|
13.2±0.1
|
0.30±0.03
|
11.2±0.2
|
0.25±0.02
|
12.5±0.2
|
Таким образом, результаты токсикометрии, данные наблюдений за экспериментальными животными на протяжении 14 дней после острого введения, а также данные некропсии позволяют отнести Индигокармин при в/ж и в/п введениях к VI классу относительно безвредных лекарственных веществ (H. Hodge et al. Clinical Toxicology of Commercial Products. Acute Poisoning. Ed. IV, Baltimore, 1975, 427 p.; K.K. Сидоров, 1973), так как при пересчете предполагаемой величины среднесмертельной дозы на общую массу препарата она попадает в соответствующий интервал степени токсичности (ЛД50 > 15000 мг/кг).
Отсутствие клинической картины интоксикации при внутрипузырном введении свидетельствует об отсутствии резорбтивного действия препарата.
Проведенные исследования свидетельствуют об отсутствии противопоказаний для клинических испытаний препарата при внутрипузырном введении по показателям острой токсичности.
Таблица 2.1.3.3
Степени токсичности лекарственных средств (по Hodge и Sterner)
Степень токсичности
|
Термин
|
ЛД50, однократно per os, крысы (мг/кг)
|
ЛД50, однократно i/v*, крысы (мг/кг)
|
1
|
Чрезвычайно токсично
|
< 1
|
< 0.1
|
2
|
Высокотоксично
|
1-50
|
0.1-5
|
3
|
Умереннотоксично
|
50-500
|
5-50
|
4
|
Малотоксично
|
500-5000
|
50-500
|
5
|
Практически нетоксично
|
5000-15000
|
500-1500
|
6
|
Относительно безвредно
|
> 15000
|
> 1500
|
* – градации степеней токсичности при внутривенном пути введения определяются посредством умножения значений стандартных доз для оценки токсичности препарата при пероральном пути введения на коэффициент 0.1
|
