Программа (мероприятие): Федеральная целевая программ «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России»
|
Скачать 396.52 Kb.
|
|
Федеральное агентство по образованию
НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ОТЧЕТ о выполнении 1 этапа Государственного контракта № П1483 от 3 сентября 2009 г.
Москва 2009 г. СПИСОК ОСНОВНЫХ ИСПОЛНИТЕЛЕЙ по Государственному контракту П1483 от 3 сентября 2009 на выполнение поисковых научно-исследовательских работ для государственных нужд Организация-Исполнитель: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Российский университет дружбы народов" ("РУДН")
Реферат Отчет 34 с., 1 ч., 7 рис., 4 табл., 40 источн., 1 прил. "лактобактерии, конканавалин А, культуральная жидкость, диафильтрация, кандидоз" В отчете представлены результаты исследований, выполненных по 1 этапу Государственного контракта № П1483 "Лектинсвязывающие адгезины прокариотической природы, биосовместимые с конкордантными рецепторами эукариотических клеток" (шифр "НК-208П") от 3 сентября 2009 по направлению "Создание биосовместимых материалов" в рамках мероприятия 1.3.1 "Проведение научных исследований молодыми учеными - кандидатами наук.", мероприятия 1.3 "Проведение научных исследований молодыми учеными - кандидатами наук и целевыми аспирантами в научно-образовательных центрах" , направления 1 "Стимулирование закрепления молодежи в сфере науки, образования и высоких технологий." федеральной целевой программы "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009-2013 годы. Цель работы - Выделение лектинсвязывающего компонента (ЛСК) из культуральной жидкости (КЖ) штамма Lactobacillus fermentum 90TS-4(21), потенциального продуцента рыхлосвязанных с клеточной стенкой структур, обладающих модулирующей действием в отношение адгезивной активности патогенной и условно-патогенной микрофлоры человека. 1.Культивирование факультативных анаэробов в присутствие в газовом составе воздуха 5% CO2 и постоянном перемешивании 2.Постановка развернутой реакций агглютинации в микропланшетах (объем лунки 50мкл) с участием конканавалина А 3. Получение лектинсвязывающего адгезина и сгущение микробной массы с помощью центрифугирования 4. Выделение лектинсвязывающего адгезина из надосадочной жидкости на ячейках фирмы «AMICON» путем диафильтрации. 1. Штамм L.fermentum 90 TS-4 (21), полученный из коллекции микроорганизмов ГИСК им.Тарасевича обладает морфологическими, культуральными и биохимическими свойствами, соответствующими справочным данным литературы. 2. Культура L.fermentum штамм 90 TS-4 (21) проявляет выраженную агглютинационную активностью в отношении КонА и реагирует с ним при концентрации последнего в растворе - 3,5*10-3мкг/мл. 3. КЖ, полученная при выращивании L.fermentum штамм 90 TS-4 (21) на жидкой питательной среде представляет собой многокомпонентную систему. Количество белка в КЖ может достигать 8450 мкг/мл. 4. Использование для концентрирования КЖ метода диафильтрации на ячейках фирмы «AMICON» (мембрана UM-20 марки «Диафло») позволяет максимально сохранить лектинсвязывающий компонент клеточной стенки лактобацилл в составе концентрата надосадочной жидкости. Содержание Введение……………………………………………………………………………………………..5 Основная часть………………………………………………………………………………………7 Аналитический обзор………………………………………………………………………..7 Выбор обоснованного варианта направления исследований…………………………….19 План проведения экспериментальных и теоретических исследований…………………21 Результаты экспериментальных и теоретических исследований………………………..27 Заключение…………………………………………………………………………………..30 Приложение………………………………………………………………………………….31 Список использованной литературы……………………………………………………………………………………32 Введение Актуальность выполнения проекта: В настоящее время для решения проблемы дисбиозов в различных терминальных ниша человека используют пробиотические препараты, содержащие микробные культуры и продукты их жизнедеятельности, либо пребиотические препараты, обеспечивающие благоприятные условия для размножения собственной резедентной флоры. Подобный подход является разумным, но не всегда терапевтически эффективным, т.к. не предусматривает принципа сайт-специфичности («ключ-замок»), обеспечивающего адресное взаимодействие микроорганизма с определенными рецепторами слизистой оболочки биониш, а следовательно и колонизацию. Этот недостаток терапевтического пособия при дисбактериозах опосредован введения в пробиотические препараты культур микроорганизмов, способных лишь к транзиторному сосуществованию с макроорганизм по причине отсутствия на их поверхности структур, обладающих универсальной биосовместимостью с рецепторами эукариотических клеток. Таким образом, микроорганизм, являющийся основой для того или иного препарата не может быть одинаково «созвучен» рецепторам клеток различных терминальных ниш, а также генетической индивидуальности человека. Поиск путей определяющих направление создания или выделения такой «структуры» позволит эффективнее проводить профилактику и лечение дисбактериозов. Цели:
Задачи:
Ожидаемые результаты. В финале данной научно-исследовательской работы предполагается получить опытный образец «препарата» ЛСК в удобной лекарственной форме с определенной терапевтической дозой для купирования влагалищного кандидоза у лабораторных животных в условия in vivo. Основная часть
Нормальная микрофлора различных биологических ниш организма человека имеет важное значение для поддержания метаболических процессов, протекающих в макроорганизме на высоком уровне, а также для создания колонизационной резистентности организма-хозяина по отношению к болезнетворным микробам. У здорового взрослого организма в биоценозе одномоментно присутствуют многочисленные представители как доброкачественной, так патогенной и условно-патогенной микрофлоры (более 400 видов бактерий), но ведущая роль в поддержании сбалансированных отношений между макроорганизмом и его микрофлорой, а также в регуляции межбактериальных взаимоотношений принадлежит основным представителям индигенных флоры терминальных ниш – бифидо- и лактобактериям [6]. Выделить из кишечника новорожденных лактобактерии можно уже через несколько дней после рождения. Работы Wilson et al. [37] и Suau et al. [34] позволили впервые исчерпывающие описать доминирующих микробных представителей кишечной микрофлоры человека с использованием чисто молекулярных методов. Данный подход основан на определении состава флоры анализом последовательностей. Основным маркером последовательности стала клонируемая 16 S рибосомальная ДНК (ADNr), признанная наиболее консервативной областью в геноме микроорганизмов. Микрофлора влагалища формируется спустя 12-24 часа после рождения [4]. Исходно в ней присутствуют только лактобактерии, в дальнейшем её дополняют другие микроорганизмы (стрептококки, стафилококки, энтерококки). Такой характер микрофлоры влагалища устанавливается с момента полового созревания в 12-13 лет и сохраняется до наступления менопаузы [9]. У здоровой женщины репродуктивного периода количество бактерий в вагинальном секрете составляет 105-106 КОЕ/мл, из них 95-98% приходится на лактобациллы [1]. Удельный вес других микроорганизмов не велик и составляет всего 2-5% [1] (табл. 1). Таблица 1. Частота встречаемости микроорганизмов других видов (помимо лактобацилл) в составе микрофлоры влагалища здоровых женщин
Используя метод ДНК-чипов для сравнения разнообразия доминирующих представителей микрофлоры, Zoetendal et al. [33] и Sutren et al. [34] заметили, что существует некоторая многоликость остова нормофлоры и она специфична для каждого индивида. Недавние исследования подтверждают, что наличие общности среди представителей микрофлоры терминальных ниш, которые являются общими для некоторой группы индивидов очень ограничено: Mangin et al. [25], сравнив флору 4 здоровых пациентов идентифицировал только один общий вид. Рисунок 1 иллюстрирует филогенетическое разнообразие микробные группы, встречающихся в микрофлоре кишечника человека при анализе сравнений последовательностей ADNr 16S [13]. Эти работы подчеркивают сложность микромира, населяющего терминальные ниши человека и значимость не охваченных представителей нормальной микрофлоры. Из изученных последовательностей 75% микроорганизмов не имеют представителей в настоящих коллекциях микробных культур. Применение антибиотиков, лекарственных средств, модулирующих состояние иммунной системы, вредное воздействие ряда внешних факторов и другие причины приводят к широкому распространению нарушений микроэкологического баланса в терминальных нишах человека. Дисбактериоз это не локальное заболевание, а основа, на которой строятся многие независимые друг от друга болезни. Большое внимание практикующие врачи уделяют дисбактериозам желудочно-кишечного и урогенитального трактов человека. Рисунок 1 Филогенетическое древо представителей микрофлоры кишечника человека [23]  В гинекологической практике возникновение дисбактериоза влагалища характеризуется резким снижением количества лактофлоры и бурным развитием условно-патогенных микроорганизмов, что приводит к развитию вагинитов и вагинозов. Применение пробиотиков на основе лактобактерий для восстановления нормальной микрофлоры является основным средством терапии в этих ситуациях, так как использование антибиотиков для элиминации патогенных микроорганизмов не приводит к стойкому терапевтическому эффекту. В соответствии с классификацией лекарственных препаратов пробиотики – это живые микроорганизмы и вещества микробного происхождения, оказывающие положительный эффекты на физические, биохимические и иммунные реакции организма хозяина через стабилизацию и оптимизацию функции его нормальной микрофлоры [3]. Внимание к препаратам – пробиотикам на территории РФ более жесткое, чем в других странах мира. В отношении потенциальных штаммов продуцентов выдвигаются следующие требования. Они должны быть:
В настоящее время для понимания положительного действия пробиотиков существует две концепции. Первая основывается на получение эффекта от действия одного единственного штамма, а вторая – от действия нескольких штаммов, характеризующихся не только высокой адгезивной активностью, но и способностью экспрессировать биологически активные молекулы [17]. Второй вариант допускает интенсивное размножение пробиотических культур в просвете терминальной экологической ниши, которая в этом случае рассматривается как «биологический ферментер» [14]. Накапливающиеся при этом в «среде культивирования» бактериоцины, металлопротеиназы, NO-синтетазы, слущивающиеся с поверхности лактобактерии специфические адгезины блокируют и дезинтегрируют условно-патогенную и патогенную микрофлору, защищая т.о. макроорганизм от бактерий потенциально способных к транслокации. Таблица 2 Препараты-пробиотики, зарегистрированные в РФ [3].
Согласно первой, классической концепции, положительный эффект от пробиотиков опосредован прямой или непрямой модуляцией эндогенной флоры и иммунной системы. В этом случае необходимым условием является непосредственный контакт пробиотической культуры с активными эпителиоцитами терминальной ниши макроорганизма. Свидетельством взаимодействия между лактобактериями и антигенпредставляющими клетками кишечника (М-клетки) стали исследования с помощью электронной микроскопии. Более ранние исследования с помощью микрочипов показали, что лактобактерии контактируя с эпителиальными клетками и индуцируют мРНК некоторых генов. Так инкубация L. plantarum 299v с линиями клеток Caco-2 и HT-29 способствует увеличению экспрессии генов MUC2 и MUC3; при этом прослеживается четкая корреляция между увеличением экспрессии мРНК и внеклеточной секрецией муцина [26]. Этот факт объясняет вероятность ингибирования, разными пробиотическими штаммами (такими как L. plantarum 299v), эпителиальной адгезии патогенных бактерий, а именно энтероинвазивных E. сoli [26]. Колонизация терминальной ниши или контакт с её стенкой может быть достигнут различными механизмами, такими как адгезия, агрегация, избыточный рост или постоянное употребление пробиотиков. В соответствии с данными Bengmark S [15], пробиотики эффективны при контроле за дисбиотическими состояниями и потенциально патогенными микроорганизмами не только бактериальной, но вирусной и грибковой природы. Ко всему прочему положительный эффект пробиотиков определяется не только антагонизмом в отношении вредоносных или нежелательными микроорганизмами, но и элиминацией токсинов и стимуляцией интестинальной иммунной защиты. Некоторые данные говорят о том, что пробиотики принимают участие в регуляции функции кишечника [15]. Таким образом, механизмы, посредством которых пробиотические культуры ингибируют патогенные микроорганизмы, включают: конкуренцию за сайты колонизации и питание, дезинтеграцию токсических компонентов и стимуляцию иммунной системы. Но эти механизмы не существуют как самостоятельные явления, они взаимно дополняют друг друга, а поэтому положительный эффект может быть итогом существования одного, нескольких или всех этих механизмов [30]. В экспериментальных моделях пробиотики нейтрализуют такие бактерии, как Salmonella typhimurium, различные виды представителей рода Shigella [31], Escherichia coli [18], Campylobacter jejuni [35] и Clostridium difficile [27]. Современные исследования преследуют цель понять механизмы взаимодействия между различными бактериями, а также между бактериями и эпителиальными клетками. Новые технологии, такие как создание микрочипов, позволяют подойти к расшифровке подобных взаимосвязей. Как было отмечено выше, модуляция эндогенной флоры происходит через антагонистическое взаимодействие между различными бактериальными штаммами, колонизирующими микронишу. Для того чтобы колонизировать данный биотоп и оказать положительное действие, пробиотические бактерии должны иметь возможность адгезировать к эпителиальным клеткам слизистых. Поэтому для штамм-специфической колонизации большое значение имеет источник используемой культуры, т.е микроорганизмы должны быть выделены от человека. Это накладывает дополнительные трудности на процесс создания пробиотического препарата индивидуального применения. Адгезивность и колонизация – ключевые моменты для конкурентного взаимодействия с патогенной и условно-патогенной флорой. Колонизация ведет к иммуномодуляции, а прямой контакт с кишечным эпителием - это предпосылка для пробиотического эффекта на иммунную систему. Молочнокислые бактерии в еде могут кратковременно колонизировать кишечник и оказывать положительный эффект. Выживание в течение пассажа через ЖКТ и адгезия к эпителию очень важно для модулирования активности иммунитета хозяина. Так как L. acidophilus штамма La1 адгезирует in vitro, можно предположить, что контакт с иммунными клетками происходит in vivo. Bifidobacterium bifidum штамм Bb12, который показывает стабильную транзиторную колонизацию, также является потенциальным иммуномодулятором [36]. Исследования по данному направлению выполнены и с использование Lactobacillus GG в дозировке 1*1010 жизнеспособных организмов в день и грибов Saccharomyces boulardii в дозировке 1г/день [28]. Впервые в 1961 году Brownelee A. и Moss W. изучая слизистую желудка крыс, обнаружили монослой лактобактерий, который не экстрагировался с поверхности клеток при интенсивной отмывки [16]. В дальнейшем многие авторы наблюдали, способность лактобацилл адгезировать на кератинизирующем эпителии в нежелезистой части желудка мышей и свиней [16,], сквамозном эпителии зоба цыплят. Были получены данные об адгезии на сквамозном эпителии ротовой полости пищеварительного тракта [19] человека, на эпителии мочевыводящих путей и эпителиальных клетках влагалища человека. Активная адгезия лактобактерий на кератинизирующем эпителии связанa с наличием на его поверхности кислых мукополисахаридов [7]. Suegora N. et al. показали, что все исследованные ими штаммы L.fermentum и L.acidophilus хорошо адгезируют на эпителии желудка крыс, но не на сквамозном эпителии зоба цыплят. При использовании эритроцитов и клеток влагалищного эпителия в качестве мишени для адгезии было отмечено, что связывание у лактобактерий, выделенных из кисломолочных продуктов значительно ниже, чем у клинических изолятов [7], откуда очевидно, что адгезивность лактофлоры во многом зависит как от вида организма, от которого взяты клетки-мишени, так и от происхождения штамма, предсуществовавшего в конкретном микробиотопе. Углеводный компонент адгезинов лактобактерий, колонизирующих сквамозный эпителий зоба цыплят, комплиментарен конА [7], который вызывает агглютинацию лактобактерий. Электронная микроскопия лактобактерий показала, что в построении их адгезивных структур принимают участие несколько слоев микробной оболочки (рисунок 2).    Рисунок 2. Электронная фотография лактобактерии (L.casei) [Brown J.P. Cytochemical Electron Microscopic Localization of Esterase Activity in Lactobacillus casei. // App. Microbiol.- Jun – 1970 - p.-1001-1004]. Стрелками указана микробная оболочка, состоящая из нескольких слоев. Изучение высокоадгезивного штамма L.salivarius №59 выявило, что в состав клеточной стенки входят три субслоя. Верхний покрыт многочисленными филаментами, берущими свое начало из более глубоких слоев, тогда как у лактобактерий штамма L.johnsonii NCC533 (La1) [19] поверхностный компонент, связывающийся с муцином клеток-мишеней, секретируется в среду культивирования. С помощью меченных коллоидальным золотом антител к этому компоненту удалось показать, что последний на поверхности лактобактерии присутствует в виде микрокапсулы (рисунок 3 А.) и одновременно интегрирует в цитоплазматический слой (рисунок 3 Б.). Многие исследователи полагают, однако, что эти образования не являются основными факторами адгезии. По мнению Rojas M. et al. [32] у L.fermentum штамма 104R за фиксацию на муцине клеток-мишеней ответственен белковый термостабильный компонент с молекулярной массой 29,0 кДа. Henriksson A. и соавторы [21], исследовавшие несколько ранее адгезивно-активные детерминанты того же штамма 104 (но в R и S - формах) L.fermentum были склонны допустить, что белковый компонент в нём всё же связан с полисахаридом.     Б А Б Рисунок 3. Электронная фотография лактобациллы [19]. А.стрелками указано наличие микрокапсулы. Б. стрелками указана пенетрация микрокапсулы в цитоплазматический слой. Такое заключение связано с тем, что филаменты не обнаруживаются в стационарной фазе роста, хотя адгезивная способность у лактобактерий в этот период максимально выражена. Можно предположить, что данные образования лишь повышают адгезивную способность лактобактерий к эпителиальным клеткам. Все выше сказанное указывает на то, что по своей химической природе адгезины лактобактерий являются сложными и неоднородными образованиями, как по структуре, так и по конгруэнтность к рецепторам клеток макроорганизма. Защитные функции лактобацилл связаны, однако не только с их способностью колонизировать слизистую оболочку влагалища, но и их способностью оказывать антимикробное действие, стимулируя иммунную систему. Недавние исследования Heinemann C. et al. [22] показывают, что биомасса L. fermentum штамма RC-14 сбрасывает в среду культивирования не только молочную кислоту, перекись водорода, ферменты, но также и некие поверхностные адгезины. В этой работе удалось выделить белок с молекулярной массой 29 кДа, блокирующий фиксацию Enterococcus faecalis 1131 на перевиваемой культуре клеток. В сходных опытах на модели L. johnsoni штамма La1 было найдено, что слущивающийся в среду культивирования адгезин, защищающий эпителиальные клетки линии Caco-2 от фиксации на них Listeria monocytogenes, E.coli и отдельных видов рода Salmonella, представляет собой белковый компонент, сочетающийся каким-то образом с липотейхоевой кислотой [20]. Некоторые виды лактобацилл (L.acidophilus, L.fermentum) обладают способностью синтезировать биосурфактант (амфифильная молекула, гликопротеидной или липопротеидной природы). Эта субстанция обладает способностью оказывать ингибирующее действия на адгезивную активность E.faecalis, E.coli, C.albicans и других уропатогенных микроорганизмов [24], что демонстрируется схематически ниже (рис.4). Рисунок 4 Схема, поясняющая барьерный эффект биосурфактанта    синтез биосурфактанта    поверхность эпителиальной клетки Утилизация лактобактериями аргинина в реакции дезаминирования с участием фермента аргининдезаминазы препятствует образованию полиаминов и тримитиламинов, которые являются причиной неприятного запаха и других явлений при вагинозах (рис.5) [24]. Рисунок 5 Действие лактобактерий, содержащих аргининдезаминазу [24]   Особое место в гинекологической практике среди инфекций урогенитального тракта занимает кандидоз. Достаточно отметить, что на протяжении всей жизни практически каждая женщина имеет хотя бы один эпизод вагинального кандидоза (ВК). По оценкам разных авторов, ежегодная обращаемость по поводу ВК составляет от 26 до 40-45 %, при этом Candida albicans остаётся доминирующим возбудителем. Согласно данным Байрамовой Г.Р. и ряда зарубежных авторов, C. albicans является причиной ВК в 85-90 % случаев, на остальные виды Candida остаётся 10-15 % [38]. В 20-22 % ВК имеет рецидивирующий характер течения, который объясняют по-разному. Одной из наиболее распространённых концепций до недавнего времени являлась теория реинфекции. Согласно ей, после излечения предыдущего эпизода ВК, возобновление симптомов инфекции обусловлено прежде всего проникновением C. аlbicans во влагалище извне: из резервуара в собственном организме (например, кишечника) или внешней среды (от полового партнера). По мнению Calderone R.A. и Fonzi W.A., колонизация зависит от интенсивности приобретения инфектанта, т.е. скорости, с которой клетки ДПГ проникают в вагину, от способности микроорганизмов к адгезии и наличия различных механизмов очищения (клиренса) слизистых [39]. В упрощённой модели это можно представить следующим образом: если скорость удаления больше, чем скорость приобретения и роста кандид, наступает очищение. Если скорость проникновения и удаления одинаковы, может быть колонизация. Если скорость удаления низкая и есть повреждения ткани, то может развиться ВК. С такой точкой зрения можно было бы согласиться лишь в том случае, если рецидив инфекции вызывался бы разными штаммами, проникающими из внешней среды. На самом деле, как было показано Sobel J.D., рецидив ВК обусловлен штаммом, постоянно присутствующим во влагалище женщины [40]. В соответствии с этим, колонизация слизистых ДПГ может закончиться приобретением и сохранением стабильной популяции кандид, которая не даёт развития клинической инфекции. Многие авторы признают, что предрасполагающим фактором для течения рецидивирующего кандидоза является развитие дисбактериоза за счёт некоторых лекарственных препаратов (антибиотиков, иммунодепресантов, кортикостероидов, контрацептивов и спермицидов). По данным Романовской Т.А. и Сергеева Ю.В., антибиотики широкого спектра действия подавляют нормальную вагинальную флору, включая лактобациллы, изменяют колонизационную резистентность, что облегчает пролиферацию ДПГ во влагалище, и приводит к рецидиву инфекции. Проблема противорецидивной терапии осложняется формированием устойчивости кандид к антимикотикам. Практически для каждого из применяемых в наши дни препаратов в роду Саndidа можно найти резистентный штамм. По механизму действия большинство антимикотиков направлено против эргостерола – компонента клеточной мембраны ДПГ. Полиеновые антибиотики непосредственно связываются с эргостеролом, нарушая барьерную функцию мембраны, а препараты, принадлежащие к классам азолов, аллиламинов, морфолинов и тиокарбаматов, подавляют синтез эргостерола. Эргостерол считается одним из важных компонентов клеточной мембраны C. albicans, по структуре и функции сопоставимый с холестеролом человека. Эргостерол обеспечивает целостность и текучесть мембраны, обеспечивая её барьерную функцию и деятельность ассоциированных с мембраной ферментов. Снижение удельного веса эргостерола приводит к фунгистатическому эффекту, поскольку эргостерол требуется как для построения мембран дочерней клетки, так и для работы связанных с мембраной материнских ферментов (например, хитин-синтазы), которые образуют материал новых клеток. Значительная нехватка эргостерола или его разрушение, при непосредственной связи с антимикотическими препаратами, приводят к фунгицидному эффекту из-за дестабилизации мембраны, нарушения градиента ионов и, в конечном счёте, образования пор в мембране и потери компонентов цитоплазмы. В этой связи возникает необходимость поиска альтернативных путей этиотропной терапии рецидивирующего вагинального кандидоза. Возможным подходом к решению этой задачи является изучение терапевтического эффекта биосовместимых веществ микробного происхождения, обладающих антагонистической активностью по отношению к C.albicans в процессе адгезии, колонизации и пенитрации. 2. Выбор обоснованного варианта направления исследований Анализ отечественной и зарубежной литературы позволяет заключить, что в настоящее время ведется активное изучение микрофлоры терминальных ниш человека. В основе этих исследований лежит не только желание определить степень общности между представителями микробиоценоз, но и установить уровень индивидуальности бактериального профиля каждого человека, порой сравнивая его с отпечатками пальцев. Кроме этого, микробиологов интересует возможность создания пробиотических препаратов универсального характера. Т.е. таких препаратов, терапевтическое воздействие которых будет основано не только на способности восстанавливать нормофлору терминальной ниши, за счет воздействия чужеродной транзиторной флоры, но и на механизмах биосовместимости с конкордантными рецепторами эукариотических клеток. Исходя из этого, мы полагаем, что сформированный метод выделения (Приложение 1), тестирования и детальное изучение воздействия лектинсвязывающего компонента клеточной стенки Lactobacterium fermentum 90 TS-4 (21) на процесс адгезии патогенной и условно-патогенной флоры в условиях in vitro позволит наглядно продемонстрировать возможность создания пробиотических препаратов нового поколения. 3.План проведения экспериментальных и теоретических исследований Для реализации первого этапа работ необходимо, во-первых, отобрать клон культуры, который будет отвечать требованиям, сформулированным в отношении всех производственных штаммов микроорганизмов, являющихся основой для пробиотических препаратов. Во-вторых, наработать культуральную жидкость, сконцентрировать её на ячейках фирмы «Amicon» и сгустить биомассу с использованием центрифугирования. Полученный опытный образец лектинсвязывающего компонента будет использован в дальнейших экспериментальных исследованиях второго и третьего этапа. Исходя из выше сказанного, выполнение НИР должно базироваться на необходимых материалах и методах. Материалы. Культуры бактерий. В работе использовали штамм лактобактерий, полученный из музея живых культур ГИСК им. Тарасевича МЗ РФ (Lactobacillus fermentum 90 TS-4 (21)).Питательные среды. Для выращивания лактобактерий использовали среды МРС-1, МРС-4 (Институт им. Г.Н. Габричевского, Россия) и среду АРТ (фирма «BD», США) следующего состава в г/л (табл. 3): Таблица 3 Питательные среды, использованные для культивирования лактобактерий
Примечание к таблице 3: Для приготовление плотной питательной среды использовали микробиологический агар – 20-25 г/л. Тест-системы.Для определения биохимических свойств лактобактерий применяли системы API-50 CHL фирмы API-System (Франция), представляющие собой планшеты с микропробирками, заполненными сухими субстратами (сахарами) (таблица 4). Таблица 4 Субстраты, использованные в планшетах с микропробирками системы API-50 CHL
При утилизации субстратов лактобактериями, питательная среда с ндикатором меняет свой цвет с фиолетового на желтый. Буферные растворы и реагенты.1. Забуференный фосфатами физиологический раствор (ФР) (ЗФР) рН-7,2. К 100 мл 0.147 М раствора хлорида натрия добавляли 76 мл 0,15 М раствора Na2HPО4x2H2O и 24 мл 0,15 М раствора КН2РО4. 2. Фосфатный буфер (PBS) рН=7,2. Для приготовления 500 мл фосфатного буфера брали 360 мл 1,2% раствора Na2HPО4x2H2O и 140 мл 0,9% раствора КН2РО4. 3. Коммерческий препарат конканавалина - А (Кон-А) (фирма SIGMA, США) использовали для изучения агглютинационной активности лактобактерий (рис.6) [Игнатов В.В. «Углеводузнающие белки-лектины», Соросовский образовательный журнал, 1997г., №2, С. 14-20 Володин Н.Н., Ефимов Б.А., Пикина А.П., Коршунова О.В., Смеянов В.В., Коршунов В.М.. Микробиологическая диагностика дисбактериозов кишечника (пособие для врачей).- М.- 1997 – 24с.]. Рисунок 6  Оборудование.1. Микроскопию мазков и изучение адгезии лактобактерий на клетках ЭВ проводили с помощью светового микроскопа МБИ-15-2, производства ЛОМО. 2. Измерение оптической плотности культур проводили на колориметре фотоэлектрическом концентрационном КФК-2МП. 3. Отмывку культуральной жидкости и разделение материала культуральной жидкости проводили на ячейках фирмы AMICON (США) методом мембранной диафильтрации с использованием мембран "Диафло" марки ХМ-300, ХМ-100 и UМ-20 и мембран с диаметром пор 0,02 мкм (стерилизующие мембраны). |
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Похожие:
 |
Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и... Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кабардино-Балкарский государственный университет... |
|
Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и... Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кабардино-Балкарский государственный университет... |
|
Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и... Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Национальный исследовательский... |
 |
1. Банковский сектор2 Федеральная целевая программа «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» |
|
Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный... |
|
Отчет о выполнении 1 этапа Государственного контракта №16. 740. 11.... Программа (мероприятие): Федеральная целевая программа «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013... |
|
Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
|
Рф федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
|
Xl научная и учебно-методическая конференция Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009–2013 годы», а также результатов,... |
|
Методические рекомендации по оформлению отчета о выполнении показателей... Фцп «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
|
Учебное пособие Петрозаводск «Карелия» 2002 Федеральная целевая программа «Культура России» Федеральная целевая программа «Культура России» (подпрограмма «Поддержка полиграфии и книгоиздания России») |
|
Инструкция по заполнению Анкеты к заявке Дату вскрытия конвертов; для конкурсов-грантов фцп «Научные и научно-педагогические кадры» указать срок подачи заявки, указанный... |
|
Программа (задача, мероприятие): Федеральная целевая программа развития... Мероприятие 5 «Распространение во всех субъектах Российской Федерации современных проектов энергосбережения в образовательных учреждениях».... |
|
Программа (задача, мероприятие): Федеральная целевая программа «Развитие... Материалы, разработанные в соответствии со II этапом Государственного контракта №05. P14. 12. 0005 от 13 ноября 2014 г |
|
Информационный бюллетень №43 (конкурсы, гранты, конференции) Апрель 2009 г Федеральная целевая программа "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса... |
|
Федеральная целевая программа «Развитие гражданской авиационной техники... «Техническое перевооружение и реконструкция научно-испытательной, опытной и производственной базы по аэродинамике и прочности, 1-й... |