К практикуму по биологической химии

Скачать 3.04 Mb.

Название	К практикуму по биологической химии
страница	8/35
Тип	Учебно-методическое пособие

rykovodstvo.ru > Руководство эксплуатация > Учебно-методическое пособие

1 ... 4 5 6 7 8 9 10 11 ... 35

Основная

Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1990. – С. 147–164.
Конспект лекций.

Дополнительная

Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. – М.: Мир, 1993.
Морозкина Т.С., Мойсеенок А.Г. Витамины: Краткое руководство для врачей и студентов медицинских, фармакологических и биологических специальностей. – Мн.: Асар, 2002.

Задания для самостоятельной работы

Задание 1

1.1. Вспомните, что согласно классификации коферменты делятся на:

1. Нуклеотидные. 2. Производные водорастворимых витаминов. 3. Металлы.

4. Алифатические соединения. 5. Ароматические соединения.

1.2. Ответьте, к какой из групп относятся следующие коферменты ФМН, ФАД, НАД, НАДФ. Напишите схематически их структуру.

Задание 2

2.1. Запомните, что основная функция водорастворимых витаминов в метаболизме — коферментная.

2.2. Выучите типы реакций, в которых участвуют основные витамины (коферменты).

2.3. Подберите соответствующие пары кофермент — тип реакции. Назовите витамины-предшественники данных коферментных форм.

1. ТГФК. А. Реакции карбоксилирования.

2. ТПФ. Б. Реакции переноса одноуглеродных фрагментов.

3. КоА. В. Реакции трансацетилирования.

4. Биотин. Г. Реакции декарбоксилирования кетокислот.

Задание 3

3.1. Запомните, что витамин В₁ — составная часть ферментов, катализирующих реакции прямого и окислительного декарбоксилирования кетокислот, а также реакции пентозофосфатного пути окисления углеводов.

3.2. Решите задачу. Как было установлено, синдром ВерникеКорсакова, проявляющийся нарушением тонуса мышц конечностей, снижением умственной способности и дезориентацией, связан с нарушением прочной связи апофермента и кофермента в ферменте транскетолазе. Симптомы этого синдрома могут проявляться у алкоголиков вследствие снижения поступления в организм витамина. Назовите этот витамин и его коферментные формы. С какими ферментами кроме транскеталазы работает этот витамин?

Задание 4

4.1. Обратите внимание на то, что витамины принимают участие в процессах метаболизма после их активации в клетках, т. е. превращения в коферментную форму.

4.2. Объясните, чем руководствовался врач, заменив больному нейродермитом пиридоксин на пиридоксальфосфат.

4.3. Подберите соответствующие пары витамин – кофермент:

А. НАД. 1. Производное витамина В₆.

Б. ТПФ. 2. Производное витамина В₂.

В. КоА. 3. Производное витамина В₁.

Г. ФАД. 4. Производное витамина В₃.

Д. ПФ. 5. Производное витамина В₅.

Правильность ответов проверьте, сопоставив их с эталонами.
Проверьте ваши знания (cамоконтроль усвоения темы)

Задание 1. Данные врачебного осмотра пожилой женщины соответствовали периферической нейропатии. Лабораторные анализы подтвердили недостаточность тиамина. Активность каких процессов снижена при данном гиповитаминозе?

А. Трансаминирование аминокислот.

Б. Декарбоксилирование аминокислот.

В. Окислительное декарбоксилирование -кетокислот.

Г. Трансметилирование аминокислот.

Д. Окислительное дезаминирование аминокислот.

Задание 2. У больного после перенесенного инфаркта в течение двух суток значительно увеличилась активность аспартатаминотрансферазы в крови. Указать кофермент данного фермента и тип катализируемой им реакции. Производным какого витамина является этот кофермент?

Задание 3. При недостатке фолиевой кислоты страдает прежде всего кроветворение и деятельность желудочно-кишечного тракта. Какие соединения входят в состав В₉? В реакциях какого типа участвует коферментная форма (назвать ее) этого витамина?

Задание 4. Гиповитаминоз пантотеновой кислоты (В₃) практически не встречается,
т. к. она обнаружена повсеместно: в тканях животных, растений, микроорганизмов. Указать кофермент данного витамина, назвать тип реакций, в которых он участвует. Изобразить схематически строение коферментной формы В₃.

Задание 5. У мужчины, в течение многих лет злоупотреблявшего алкоголем, появились воспаления слизистой оболочки языка, губ, помутнение хрусталика, общая мышечная слабость. В анализе крови установлено значительное снижение активности глутатион-редуктазы эритроцитов. Активность фермента выросла после добавления в пробу рибофлавина. Какой кофермент входит в состав глутатион-редуктазы эритроцитов?

А. ТПФ. Б. ФАД. В. НАД. Г. ТГФК. Д. ПФ.

Задание 6. Больному сделана операция резекции желудка, после чего вследствие недостаточности витамина В₁₂ у него развилась анемия. Назовите коферментные формы этого витамина. В каких реакциях они принимают участие?

Задание 7. Студентке, которая в течение длительного времени питалась в основном очищенным рисом и поэтому не получала витамина В₁, врач поставил предварительный диагноз — полиневрит (бери-бери). Нарушение каких метаболических путей будет наблюдаться при отсутствии В₁?

Задание 8. К врачу обратился пациент с жалобами на воспалительные процессы кожи (дерматит), сопровождающиеся усиленной деятельностью сальных желез, выпадением волос — типичными признаками недостаточности витамина Н. Объясните, какие реакции обмена нарушаются при этом.
Эталоны ответов к решению заданий

Для проверки исходного уровня знаний:

1 – В; 2 – пиримидин, имидазол.

Для самостоятельной работы

1.2. Нуклеотидные.

2.3. 1 (В₉) – Б; 2 (В₁) – Г; 3 (В₃) – В; 4 (Н) – А.

3.2. В₁, его коферментные формы ТМФ, ТДФ, ТТФ.

4.3. А – 5; Б – 3; В – 4; Г – 2; Д – 1.
Самостоятельная работа (60 минут)

Инструкция к практическому занятию

Для обнаружения витаминов в различных веществах и биологических жидкостях и определения их количества существуют качественные реакции, основанные на цветных реакциях, характерных для той или иной группировки, входящей в витамин.
Работа 1. Качественные реакции на витамин В₁

Витамин В₁ состоит из пиримидинового и тиазолового колец. Витамин В₁ получил название тиамина потому, что содержит серу и азот.

1. Реакция окисления

Принцип метода. В щелочной среде тиамин окисляется в тиохром феррицианидом калия. Тиохром обладает синей флюоресценцией при ультрафиолетовом облучении раствора на флюороскопе.

Ход работы. К 1 капле 5 % раствора тиамина прибавляют 5–10 капель 10 % раствора едкого натра, 1–2 капли 5 % раствора феррицианида калия и взбалтывают. Прогрев флюороскоп, наблюдают синюю флюоресценцию при облучении раствора ультрафиолетовыми
лучами.

2. Диазореакция

Принцип метода. В щелочной среде тиамин с диазореактивом образует сложное комплексное соединение оранжевого цвета.

Ход работы. К диазореактиву, состоящему из 5 капель 1 % раствора сульфаниловой кислоты и 5 капель 5 % раствора нитрата натрия, добавляют 1–2 капли 5 % раствора тиамина и затем по стенке, наклонив пробирку, осторожно добавляют 5–7 капель 10 % раствора бикарбоната натрия. На границе двух жидкостей появляется кольцо оранжевого цвета.
Работа 2. Качественная реакция на витамин В₂

Витамин В₂ — рибофлавин — состоит из изоаллоксазинового ядра и спирта рибитола.

Принцип метода. Окисленная форма витамина В₂ представляет собой желтое флюоресцирующее в ультрафиолетовых лучах вещество. Реакция на витамин В₂ основана на его способности легко восстанавливаться. При этом раствор витамина В₂, обладающий желтой окраской, приобретает сначала розовый цвет за счет образования промежуточных соединений, а затем обесцвечивается, т. к. восстановленная форма витамина В₂ бесцветна.

Ход работы. В пробирку наливают 10 капель раствора витамина В₂, добавляют 5 капель концентрированной хлористоводородной кислоты и опускают зернышко металлического цинка. Начинается выделение пузырьков водорода, жидкость постепенно розовеет, затем обесцвечивается. Сравнивают обе формы витамина В₂ по флюоресценции.
Работа 3. Качественная реакция на витамин РР

Витамин РР — производный пиридинового ядра. Антипеллагрической активностью, помимо никотиновой кислоты, обладает и ее амид.

Принцип метода. Витамин РР при нагревании с раствором ацетата меди образует плохо растворимый синий осадок медной соли никотиновой кислоты.

Ход работы. Наливают в пробирку 20 капель 3 % раствора витамина РР (перед определением раствор обязательно следует взболтать) и нагревают до кипения; при этом мутный раствор становится прозрачным. Взболтав 5 % раствор ацетата меди, приливают 20 капель его к нагретому раствору витамина РР. Содержимое пробирки доводят до кипения и сразу охлаждают под струей холодной воды. На дне пробирки выпадает синий осадок медной соли никотиновой кислоты.
Работа 4. Качественная реакция на витамин В₆

Группа витамина В₆: пиридоксол, пиридоксаль, пиридоксамин, являющиеся производными пиридина и носящие общее название пиридоксина, обладают активностью витамина В₆.

Принцип метода. Витамин В₆ при взаимодействии с раствором хлорного железа образует комплексную соль типа фенолята железа красного цвета.

Ход работы. К 5 каплям 1 % раствора витамина В₆ приливают равное количество 1 % раствора хлорного железа и перемешивают. Развивается красное окрашивание.
Работа 5. Качественная реакция на витамин В₁₂

В₁₂ — единственный витамин, содержащий в своей структуре металл (кобальт). Кобальт связан координационной связью с четырьмя атомами азота, входящими в состав порфириноподобной структуры (корриновое ядро) и с атомом азота 5,6-ди-метилбензимидазола.

Принцип метода. При взаимодействии ионов кобальта с тиомочевиной при нагревании образуется роданид кобальта зеленого цвета.

Ход работы. На беззольный фильтр наносят 2–3 капли раствора тиомочевины и высушивают над пламенем спиртовки. После этого наносят на фильтр 1–2 капли минерализата (В₁₂) и снова нагревают фильтр над спиртовкой. На фильтре, чаще по краю, появляется зеленое окрашивание, свидетельствующее о наличии кобальта.

Результаты опытов записывают в таблицу:

№	Название опыта	Наблюдаемые изменения	Выводы

Выводы:
Подпись преподавателя:

Тема 9. Введение в метаболизм. Цикл трикарбоновых кислот (лимоннокислый цикл Кребса) —
центральный метаболический путь

Актуальность темы

Знание закономерностей и особенностей метаболизма необходимо для дальнейшего изучения обмена углеводов, липидов и белков на уровне клетки и организма, для понимания механизмов регуляции их метаболизма и возможной коррекции нарушений обмена веществ. Усвоив значение центрального метаболического пути для энергообеспечения клеток, можно понять причины гипоксических состояний и их связь с клеточной энергетикой. Поскольку нарушения энергетического обмена лежат в основе патогенеза многих заболеваний, знание механизма функционирования цикла Кребса позволит врачу провести правильную коррекцию метаболических нарушений (кокарбоксилаза, компоненты адениловой системы, сукцинат и др.).

Цель занятия

Получить представление о метаболизме, анаболических и катаболических метаболических путях, их взаимосвязи на различных уровнях. Сформировать представление о лимоннокислом цикле Кребса как центральном метаболическом пути, о значении его водороддонорной функции для дальнейших окислительно-восстановительных реакций в цепи тканевого дыхания, понять катаболическую и анаболическую функции цикла Кребса.

Требования к исходному уровню знаний

Для полного усвоения темы необходимо повторить из:

биологии:

понятие «обмен веществ», понятия «ассимиляция», «диссимиляция» и связь между ними;

общей химии:

понятие «окислительно-восстановительные реакции», способы окисления веществ, основы биоэнергетики, понятия «макроэргическая связь», «макроэрг»;

биоорганической химии:

строение АМФ, АДФ, АТФ, пирофосфата, дикарбоновых, трикарбоновых кислот, альфа-кетокислот, гидроксикислот;

нормальной физиологии:

понятие «основной обмен», энергетическая роль обмена веществ;

цитологии:

структура митохондрий;

биохимии:

класс оксидоредуктазы;
подкласс дегидрогеназы; строение коферментов ФМН, ФАД, НАД, НАДФ; реакции декарбоксилирования; роль витаминов В₁, В₃ в обмене веществ, их коферментные формы.

Для проверки исходного уровня знаний выполните следующие задания:

Задание 1. К раствору гидрохинона добавили окислитель, в результате чего раствор потемнел. Какова причина изменения окраски гидрохинона?

А. Гидрохинон присоединил 2 электрона.

Б. Гидрохинон окислился.

В. Гидрохинон присоединил 2 атома водорода.

Г. Гидрохинон восстановился.

Д. Гидрохинон отдал 2 атома водорода.

Задание 2. Проанализируйте формулы указанных соединений и укажите, к какому классу веществ они относятся.

А. Дикарбоновые кислоты. Б. Трикарбоновые кислоты.

В. Монокарбоновые кислоты. Г. -Кетокислоты. Д. Гидроксикислоты.

Задание 3. К написанным ниже реакциям подобрать ферменты. Указать класс.

3.1.	3.2.
3.3.

3.4. Указать витамин и его коферментную форму, необходимую для протекания реакции 3.2.
Правильность решений проверьте, сопоставив их с эталонами ответов.
Вопросы для обсуждения

Метаболизм, линейные и циклические метаболические пути, регуляторные (ключевые) ферменты.
Катаболизм и анаболизм, различия и взаимосвязь между ними.
Реакции дегидрирования как основной способ окисления веществ в организме, дегидрогеназы как подкласс класса оксидоредуктаз. Пиридинзависимые и флавинзависимые дегидрогеназы. Роль витаминов РР и В₂ в окислительно-восстановительных реакциях. Схематическое строение коферментов НАД⁺, НАДФ⁺, ФАД, ФМН.
Адениловая система клетки, ее участие в энергетическом обмене. Центральная роль АТФ в процессах, связанных с затратой энергии. Способы синтеза АТФ: субстратное, окислительное и фотосинтетическое фосфорилирование. Понятие о макроэргах.
Цикл трикарбоновых кислот (ЦТК) как центральный метаболический путь. Локализация ферментов ЦТК, химизм реакций (схема), ферменты, коферменты.
Дегидрогеназные реакции ЦТК как источник водорода для системы тканевого дыхания. Декарбоксилирование в цикле Кребса как механизм образования в клетках СО₂ — конечного продукта катаболизма соединений углерода.
Функции ЦТК: катаболическая, анаболическая, анаплеротическая. Регуляция.

ЛИТЕРАТУРА

Основная

Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1990. – С. 204–212, 261–267.
Николаев А.Я. Биологическая химия. – М.: Высшая школа, 1989. – С. 160–164, 172–175, 215–222.
Конспект лекций.

Дополнительная

1. Мари Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. – М.: Мир, 1993.

2. Л.Страйер. Биохимия. – М.: Мир, 1985.  т. 2.  с. 6–21, 49–68.
Задания для самостоятельной работы

Для усвоения материала темы следует обратить внимание на то, что:

ЦТК представляет собой конечный общий путь для окисления продуктов распада белков, жиров и углеводов.
ЦТК служит источником строительных блоков для процессов биосинтеза (гем, аминокислоты, глюкоза и т. д.)
Большинство топливных молекул вступают в цикл в виде ацетил-КоА.
В ходе реакций цикла дважды происходит декарбоксилирование с образованием конечного продукта — СО₂.
В результате 4-х дегидрогеназных реакций восстанавливаются 3 молекулы НАД⁺ и 1 молекула ФАД. Эти восстановленные переносчики окисляются затем в цепи переноса электронов внутренней мембраны митохондрий.
ЦТК функционирует только в аэробных условиях, поскольку регенерация восстановленных коферментов происходит только при переносе электронов на О₂.
Перенос электронов на кислород сопряжен с одновременным образованием АТФ (окислительное фосфорилирование). Скорость цикла зависит, в первую очередь, от энергетического заряда клетки.

Задание 1. У экспериментальных животных исследовали влияние витаминов на скорость ЦТК. При отсутствии какого витамина скорость реакций ЦТК не нарушалась:

А. Цианокобаламин. Б. Тиамин. В. Пантотеновая кислота.

Г. Никотинамид. Д. Рибофлавин.
Задание 2. В ходе реакций цикла Кребса происходит восстановление коферментов четырех дегидрогеназ. Укажите субстраты ЦТК, причастные к появлению атомов водорода в составе соответствующих коферментов:

А. Цитрат. Б. -Кетоглутарат. В. Фумарат.

Г. Малат. Д. Аконитат. Е. Изоцитрат. Ж. Сукцинат.
Задание 3 .Подберите ферменты к соответствующим реакциям.

3.1. оксалоацетат + ацетил-КоА + Н₂О  цитрат + КоA-SH.

3.2. изоцитрат +НАД⁺  - кетоглутарат + НАДН^.Н⁺ + СО_2.

3.3. сукцинил-КоА + ГДФ +Н₃РО₄  Сукцинат + ГТФ + КоА-SH.

3.4. фумарат + Н₂О  малат.

А. Фумаратгидратаза. Б. Цитратсинтаза.

В. Сукцинаттиокиназа. Г. Изоцитратдегидрогеназа.
Задание 4. К каждому ферменту подберите соответствующий кофермент:

4.1. Сукцинатдегидрогеназа. А. ФМН.

4.2. НАДН-дегидрогеназа. Б. ФАД.

4.3. Малатдегидрогеназа. В. НАД.

4.4. -Кетоглутаратдегидрогеназа. Г. ТПФ.

Д. КоА-SH.

Е. Липоевая кислота.
Правильность решений проверьте, сопоставив их с эталонами ответов.
Проверьте ваши знания (самоконтроль усвоения темы)

Задание 1. В цикле лимонной кислоты для расщепления ацетил-КоА используются 8 ферментов:

1) цитратсинтаза; 2) аконитаза; 3) изоцитратдегидрогеназа;

4) -кетоглутаратдегидрогеназа; 5) сукцинил-КоА-синтетаза;

6) сукцинатдегидрогеназа; 7) фумараза; 8) малатдегидрогеназа.

1.1. Напишите химическую реакцию (схема), катализируемую каждым из этих ферментов.

1.2. Какой кофактор или кофакторы необходимы для работы III, IV, VI и VIII ферментов.

1.3. Для каждого из ферментов укажите, к какому из перечисленных ниже типов принадлежит катализируемая им реакция: конденсация, дегидратация, гидратация, декарбоксилирование, окислительно-восстановительная реакция, фосфорилирование на уровне субстрата, изомеризация.

1.4. Укажите, к какому классу относится каждый из ферментов цикла Кребса.

Задание 2. У экспериментального животного на фоне внутривенного введения глюкозы определили снижение активности ферментов ЦТК. Какие соединения являются непосредственными их ингибиторами?

А. НАДФН^.Н⁺. Б. НАД⁺. В. НАДН^.Н⁺. Г. АТФ. Д. АДФ.

Задание 3. Будет ли происходить накопление оксалоацетата, если к экстракту, содержащему ферменты и коферменты ЦТК, добавить ацетил-КоА? Объясните Ваш ответ.

Задание 4. В клинику доставили пострадавших во время землетрясения, находившихся без пищи 10 дней. Исследования активности ферментов ЦТК показали резкое снижение скорости этого процесса. Какие последствия это имеет для организма?

А. Обезвоживание. Б. Снижение уровня АТФ.

В. Снижение уровня глюкозы в крови.

Г. Образование большого количества эндогенной воды.
Эталоны ответов к решению заданий

Для самопроверки и самоконтроля исходного уровня знаний:

1  Б, Д. 2.1  А. 2.2  Г. 2.3  Д. 2.4  Б. 2.5  В.

3.1  дегидрогеназа, I. 3.2  декарбоксилаза, IV. 3.3  дегидратаза IV. 3.4  витамин В₁ (ТПФ).

Для самостоятельной работы:

1  А. 2  Б, Г, Е, Ж. 3.1  Б. 3.2  Г. 3.3  В. 3.4  А. 4.1  Б. 4.2  А. 4.3  В. 4.4  Б, В, Г, Д, Е.
Самостоятельная работа (60 минут)

Инструкция к практическому занятию

Работа 1. Изучение функционирования ЦТК по убыли ацетил-КоА

Принцип метода. Первый этап ЦТК — реакция конденсации ацетил-КоА с оксалоацетатом, которая осуществляется цитратсинтазой. Образовавшаяся лимонная кислота подвергается превращению в цикле трикарбоновых кислот, а освободившийся КоА-SH можно определять, используя реактив Фолина (появляется синее окрашивание). Если блокировать ЦТК малоновой кислотой, то ацетил-КоА не используется и КоА-SH не образуется. Готовый гомогенат получить у лаборантов.

Схема постановки опыта

№ п/п	Содержимое пробирок	Контроль	Опыт
1	Фосфатный буфер рН=7,4	2,0 мл	2,0 мл
2	Р-р ацетил-КоА	0,5	0,5
3	Р-р оксалоацетата	0,5	0,5
4	Р-р малоновой кислоты	1,0	
5	Физиологический р-р		1,0
6	Гомогенат печени	0,5	0,5
Инкубация 10 минут при комнатной температуре
7	Реактив Фолина А	0,5	0,5
8	Реактив Фолина Б	0,5	0,5

Результат (окраска растворов):

Выводы:

Работа 2. Изучение функционирования ЦТК по образованию углекислого газа

Принцип метода. При окислении ацетил-КоА в ЦТК образуется углекислый газ, который связывается гидроксидом кальция и определяется при добавлении серной кислоты по выделению пузырьков газа.

Схема постановки опыта

№ п/п	Содержимое пробирок	Контроль	Опыт
1	Фосфатный буфер рН=7,4	2,0 мл	2,0 мл
2	Р-р ацетил-КоА	0,5	0,5
3	Р-р оксалоацетата	0,5	0,5
4	Р-р малоновой кислоты	1,0	
5	Инкубационный р-р		1,0
6	Р-р Ca(OH)₂	1,0	1,0
7	Гомогенат печени	0,5	0,5
Инкубация 10 минут при комнатной температуре
8	0,1 н р-р серной кислоты	1,0	1,0

Результат (выделение углекислого газа):

Выводы:

Работа 3. Изучение функционирования ЦТК по образованию атомов водорода

Принцип метода. При окислении ацетил-КоА в ЦТК образуется 8 атомов водорода, которые отщепляются при участии соответствующих дегидрогеназ, в качестве акцептора используется 2,6-дихлорфенолиндофенол (2,6-ДХФИ). Если цикл функционирует, то 2,6-ДХФИ восстанавливается и обесцвечивается.