Методические рекомендации по применению наборов реагентов для выявления генов карбапенемаз методом полимеразной цепной реакции (пцр) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс Ò mdr mbl fl» и «АмплиСенс Ò mdr kpc/oxa-48-fl»

Скачать 278.56 Kb.

Название	Методические рекомендации по применению наборов реагентов для выявления генов карбапенемаз методом полимеразной цепной реакции (пцр) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс Ò mdr mbl fl» и «АмплиСенс Ò mdr kpc/oxa-48-fl»
страница	2/2
Тип	Методические рекомендации

rykovodstvo.ru > Руководство эксплуатация > Методические рекомендации

1 2

ПРОВЕДЕНИЕ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ, АНАЛИЗ И УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРИ ПОМОЩИ ПРИБОРОВ CFX-96 и CFX-384 (Bio-Rad, США)

Провести этапы пробоподготовки и приготовления реакционных смесей согласно инструкции к набору реагентов. Для проведения амплификации рекомендуется использование тонкостенных пробирок для ПЦР объемом 0,2 мл с круглой или плоской оптически прозрачной крышкой (детекция через крышку пробирки).

Программирование амплификатора осуществлять согласно инструкции производителя набора:

Включить прибор и запустить программу Bio-Rad CFX Manager.
В стартовом окне программы выбрать пункт Create a new Run. Назначить для выполнения программу амплификации и детекции «АмплиСенс-B» или универсальную программу амплификации и детекции «АмплиСенс-1» . Для этого выбрать или создать эту программу в модуле Experiment Setup в окне Protocol Editor. Задать объем реакционной смеси Sample Volume – 25 мкл.

При анализе проб ДНК, полученных при экстракции с помощью реагента «ГК-экспресс» из образцов гемокультуры, чистой культуры или смеси бактериальных культур, полученной путем посева на питательную среду, используется программа «АмплиСенс-B». При анализе проб ДНК, полученных из образцов исходного клинического материала, или проб ДНК, полученных при экстракции с помощью комплекта реагентов «ДНК-сорб-АМ» из образцов гемокультуры, чистой культуры или смеси бактериальных культур, используется программа «АмплиСенс-1».

Программа «АмплиСенс-B» для приборов планшетного типа

Цикл	Температура, °С	Время	Измерение флуоресценции	Кол-во циклов
1	95	15 мин	-	1
2	95	5 с	-	35
	60	30 с	FAM, HEX, ROX, Су5, Quasar705
	72	15 с	-

Программа «АмплиСенс-1» для приборов планшетного типа

Цикл	Температура, °С	Время	Измерение флуоресценции	Кол-во циклов
1	95	15 мин	–	1
2	95	5 с	–	5
	60	20 с	–
	72	15 с	–
3	95	5 с	–	40
	60	30 с	FAM, HEX, ROX, Су5, Quasar705
	72	15 с	–

ВНИМАНИЕ! Для каждого шага этапов циклирования, нажав на кнопку Step Options задать скорость нагревания/охлаждения Ramp Rate 2,5 °С/sec (см. рис.).

В следующем окне (модуль Plate) задать схему планшета – указать расположение образцов в реакционном блоке и назначить детекцию флуоресценции по пяти каналам FAM, HEX, ROX, Cy5, Quasar705 для всех образцов. Для этого с помощью кнопки Select Fluorophores… выбрать (отметить галочками) нужные флуорофоры в списке. Для всех проб ДНК из клинических образцов и отрицательных контролей в поле Sample type выбрать Unknown. Указать идентификаторы образцов в поле Sample name. Сохранить файл схемы планшета, нажать кнопку OK.

Примечание – Канал Quasar705 включается при необходимости, если одновременно проводятся тесты в формате «МУЛЬТИПРАЙМ», для которых используется этот канал.

Открыть крышку прибора с помощью кнопки Open Lid. Поставить реакционные пробирки в ячейки амплификатора в соответствии с заданной схемой планшета. Закрыть крышку прибора кнопкой Close Lid.
Запустить выполнение выбранной программы с заданной схемой планшета, нажав кнопку Start Run.
После окончания выполнения программы амплификации и детекции можно приступить к анализу результатов.

Анализ результатов

Анализ результатов выполняется отдельно (последовательно) для каждого канала флуоресцентной детекции, в соответствии с инструкцией к набору реагентов и описанием в данном разделе.

Результаты амплификации фрагментов генов карбапенемаз различных групп регистрируются по различным каналам флуоресцентной детекции в соответствии с табл. 5.

Таблица 5

Анализ результатов по группам генов

Канал детекции	FAM	HEX	ROX	Cy5
ДНК-мишень при использовании набора «АмплиСенс^Ò MDR MBL-FL»	гены МБЛ группы VIM	гены МБЛ группы IMP	ВКО	гены МБЛ группы NDM
ДНК-мишень при использовании набора «АмплиСенс^Ò MDR KPC/OXA-48-FL»	гены карбапенемаз группы KPC	гены карбапенемаз группы OXA-48-подобных	ВКО	-

Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения графика флуоресценции с пороговой линией, установленной на уровне экспоненциального подъема сигнала, что определяет наличие (или отсутствие) для данной ДНК-мишени значения порогового цикла Ct (Cq) в соответствующей графе таблицы результатов.

Запустить программу и открыть сохраненный файл. Для этого выбрать в меню File, затем Open и Data file, и выбрать файл данных.
Проанализировать данные отдельно по каждому каналу, выключив все остальные каналы (сняв галочку в боксе с обозначением канала под основным окном с графиками Amplification).
Для каждого канала установить пороговую линию так, чтобы она пересекала графики накопления флуоресцентного сигнала только на участке характерного экспоненциального подъема и не пересекала базовую линию. В случае, если автоматически выбранный уровень пороговой линии не соответствует этому требованию, следует повысить уровень порога. Пороговая линия для каждого канала, кроме канала ROX, устанавливается на уровне, соответствующем 10-20 % от максимального уровня флуоресценции, полученного для образца К+ в последнем цикле амплификации. Для канала ROX пороговая линия устанавливается на уровне, соответствующем 10-20 % от максимального уровня флуоресценции, полученного для образца B–.
В таблице результатов появятся значения пороговых циклов Cq для анализируемого (включенного) канала.

Учет результатов

Результаты ПЦР-исследования считаются достоверными, если получены правильные результаты для отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК («К–» и «В–») и положительного контроля ПЦР («K+»), в соответствии в соответствии с инструкцией и вкладышем к набору реагентов.

ВНИМАНИЕ! Для исследуемых образцов положительной гемокультуры, смеси бактериальных культур, полученных путем посева клинического материала, чистой культуры результат выявления той или иной группы генов карбапенемаз учитывается как достоверный, если полученное значение порогового цикла Ct по соответствующему каналу не превышает граничного значения (в соответствии со вкладышем). Если полученное значение Ct превышает граничное значение, то результат анализа – сомнительный, требуется провести повторный анализ образца, начиная с этапа экстракции ДНК.

Лист вносимых изменений

Редакция	Место внесения изменений	Суть вносимых изменений
21.01.13 IvI	По тексту	В примечании об одновременном проведении тестов в формате «МУЛЬТИПРАЙМ», удалено упоминание канала Су5 и Cy5 / Crimson
30.07.13 FN	Титульная страница	Символ RUO заменен на символ IVD
	Титульная страница	Добавлены печать и подпись врио директора ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора
	Назначение	Добавлена таблица «Соответствие названий флуорофоров и каналов детекции»

1 Название каналов детекции для соответствующего детектора см. в соответствующем разделе методических рекомендаций к набору реагентов.

1 2

Похожие:

	Инструкция по применению набора реагентов для выявления генов металло--лактамаз... Внутренний контрольный образец для наборов с гибридизационно-флуоресцентной детекцией		Инструкция по применению тест-системы «хла-псит» «хла-псит» для выявления возбудителя хламидиоза Chlamydophila psittaci методом полимеразной цепной реакции
	1. назначение Наборы реагентов GenePak® dna pcr test предназначены для обнаружения ДНК возбудителей инфекционных заболеваний в биологических пробах...		Инструкция по применению тест-системы «чис» «чис» для определения видовой принадлежности тканей кур и свиней методом полимеразной цепной реакции
	Прайс-лист наборы реагентов для пцр-диагностики Оборудование и расходные материалы Обращаем Ваше внимание на то, что наборы реагентов для диагностики урогенитальных инфекций в качественном frt/fep формате и папилломавирусной...		Инструкция по применению наборы реагентов для определения соматических... Набор реагентов для определения соматических мутаций в гене egfr «Therascreen® egfr rgq pcr kit (24)» на 24 образца
	Инструкция по применению Наборы реагентов для определения соматических... Набор лабораторных реагентов для определения соматических мутаций в гене braf «braf rgq pcr kit (24)»		Инструкция по применению «вич-1,2 аг/ат комботест» Набор реагентов «вич -1,2 аг/ат комботест», далее по тексту – Набор, предназначен для одновременного выявления антител к вич 1 типа,...
	Инструкция по применению набора реагентов для иммуноферментного определения тироксина Набор реагентов «Тироидифа-тироксин-01» предназначен для количественного определения концентрации тироксина в сыворотке крови человека...		Инструкция по применению набора реагентов для иммуноферментного определения свободного тироксина Набор реагентов Тироидифа-свободныйТ4 предназначен для количественного определения содержания свободного тироксина (Т4) в сыворотке...
	Инструкция по применению набора реагентов для количественного определения... Набор «глюкоза uts» разрешен к производству, продаже и применению на территории РФ		Набор реагентов для количественного определения содержания мочевины Набор предназначен для количественного определения мочевины в сыворотке крови и моче человека уреазным методом по салицилат-гипохлоритной...
	Документация о закупке у единственного поставщика на право заключения... Пцр диагностики, для нужд Государственного учреждения здравоохранения «Тульский областной кожно-венерологический диспансер»		Инструкция по применению набора реагентов для определения активности... Набор реагентов «щф-uts» предназначен для определения активности щелочной фосфатазы (ЩФ) в сыворотке или плазме крови человека в...
	Методические рекомендации к практическому занятию для студентов по... Неотложная помощь в приступном периоде. Острые аллергические реакции у детей генерализованные (анафилактический шок и токсико-аллергические...		К конкурсной документации Реагент для количественного определения содержания бета-Хорионического гонадотропина в сыворотке крови человека методом твердофазного...

Руководство, инструкция по применению